Руколь В. М.
ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Введение

На современном этапе интенсификации животноводства актуальной проблемой является профилактика и лечение животных с гнойно-некротическими заболеваниями. Несмотря на большое количество исследований и публикаций относительно методов лечения животных с гнойной патологией, большинство предлагаемых препаратов не дают ожидаемых результатов и оказываются недостаточно эффективными. В последние годы для лечения животных с хирургической инфекцией активно используются биологические методы лечения с использованием средств растительного, животного и бактериального происхождения. Биологическая терапия основана на повышении аутоантисептических защитных сил организма. Из бактериальных препаратов все чаще используются пробиотики, основу которых составляют безвредные для теплокровных животных микроорганизмы. Принцип действия данных препаратов заключается в антагонизме составляющих их основу микробов   к   условно-патогенной   и   патогенной микрофлоре. Эти препараты применяют с водой или кормом для лечения и профилактики различных заболеваний. Попадая в желудочно-кишечный тракт, присутствующие в этих препаратах микроорганизмы размножаются, синтезируют многие биологически активные вещества (органические кислоты, липиды, витамины, антибиотики, иммуномодуляторы и т. п.) и повышают неспецифическую резистентно сть организма-хозяина [1, 2, 3, 4].

Аэробные спорообразующие бактерии из рода Bacillus привлекают внимание исследователей различных направлений. Высокая антагонистическая активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, продукция биологически активных веществ, наряду с безвредностью, обусловливают перспективность использования этих бактерий в качестве основы для разработки лечебно-профилактических препаратов. Препараты на основе Bacillus subtilis имеют высокую эффективность при заболеваниях бактериальной этиологии. По данным В. И. Никитенко, через 1-7 дней после операционного вмешательства в просвете заживающих ран были обнаружены бактерии Bacillus subtilis. Эти бактерии обладают способностью подавлять рост наиболее частых возбудителей хирургических инфекций: стафилококков, протея и др. Кроме того, вырабатывают протеолитические ферменты, разлагающие мертвые клетки, иммуномодуляторы, а также ряд биологически активных веществ [5, 7].

Эти данные натолкнули на мысль перейти от агрессивной для организма химической антисептики и пассивной асептики к активной форме борьбы с патогенной микрофлорой в ране с помощью антагонистически активных непатогенных спорообразующих бактерий. Все отмеченное выше показывает, что разработка современного эффективного и недорогого метода лечения крупного рогатого скота с гнойно-некротическими заболеваниями является перспективной практической задачей для ветеринарной науки и практики.

В связи с этим целью нашей работы явилось создание и клиническое испытание нового препарата - геля «Ветоспорин» для терапии животных с гнойной патологией, который относится к препаратам с многофункциональным влиянием на течение гнойного процесса.

Материалы и методы

Исследование проводилось в несколько этапов. На первом этапе проводилось изучение этиологической структуры возбудителей бактериальных инфекций гнойно-некротических поражений крупного рогатого скота. Исследованию подвергался патологический материал, отобранный от 20 больных животных, принадлежащих хозяйству Минского района. Исследование проводилось по общепринятым методикам.

На втором этапе проводилось изучение антагонистической активности различных штаммов бацилл в отношении бактерий из гнойных экссудатов от коров. Для этого из коллекции лаборатории средств биологического контроля Института микробиологии НАН Беларуси получены штаммы-антагонисты (11-10, I2-17, M 22, 10/19, 9/9, 9/2, 8/12, 7/1) вида Bacillus subtilis.  Антагонистическую активность определяли по диаметру зоны задержки роста бактерий из гнойных экссудатов от коров вокруг лунки с исследуемым штаммом.

Третий этап эксперимента проводился в лаборатории технологии лекарственных средств на фармацевтическом факультете Витебского государственного медицинского университета. Он включал в себя разработку и дальнейшее исследование гелевой лекарственной формы пробиотиков.

На следующем этапе проводилось кли-ническое испытание геля «Ветоспорин» лабораторных животных. Влияние пробиотиков на организм учитывалось при заживлении гнойных ран у кроликов. Для этого было использовано четыре кролика в возрасте 0,7-1 год массой 3-3,5 кг средней упитанности, две самки и два самца. Все животные были клинически здоровые и содержались в индивидуальных клетках. Всем животным в области бедра подготовили операционное поле размером 5x7 см, провели инфильтрационное обезболивание по месту разреза, затем были нанесены кожно-мышечные раны длиной 2,5-3 см. В рану кролика под № 1 была помещена музейная культура Escherichia coli, в рану кролика под № 2 - культура Streptococcus pyogenes, кролику под № 3 произвели заражение раны Staphylococcus epidermidis, кролику № 4 в рану была внесена ассоциация микроорганизмов Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis. Затем раны были закрыты стерильными марлевыми салфетками и закреплены коллодием. Перед нанесением ран, на первые, третьи, седьмые и четырнадцатые сутки проводили клиническое исследование кроликов (подсчитывали пульс, дыхание, измеряли температуру и учитывали динамику воспалительной реакции), а также были отобраны пробы крови для исследований.

Результаты и обсуждение

При изучении этиологической структуры возбудителей бактериальных инфекций из гнойно-некротических поражений крупного рогатого скота получены данные, которые представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты выделения микрофлоры от коров с гнойно-некротическими болезнями дистальных отделов конечностей

Таблица 2.

Результаты антагонистической активности различных штаммов бацилл в отношении бактерий из гнойных экссудатов от коров

Из данных таблицы 1 видно, что при гнойно-некротических болезнях в дистальных областях конечностей у коров наиболее часто выявляются микроорганизмы Pseudomonas aeraginosa (100 %), Staphylococcus aureus (59,4 %), Escherichia coli (52,8 %), Staphylococcus epidermidis (46,2 %), Proteus vulgaris (39,6 %), Streptococcus pyogenes (26,4 %) и Klebsiella species (6,6 %).

При изучении антагонистической актив-ности различных штаммов бацилл в отно-шении патологического материала от коров, больных гнойно-некротическими болезнями, тест-объектами служил экссудат из патологического процесса. В качестве антагонистов использовали 5 штаммов бак-терий  Bacillus,   культивирование  которых проводилось в среде Мейнелла с мелассой и в колбах Эрленмейера в течение 5 суток на качалке при 30 °С. Проверялись как су-пернатанты, так и неотцентрифугированная культуральная жидкость бактерий с клетками. Пипеткой вносили 100 мкл культуры исследуемого штамма стерильно в лунки, проделанные в двухслойном агаре (МПА 2 % + МПА 1,2 %) с биоматериалом из раневой поверхности. Через сутки культивирования в термостате при 37 °С оценивали резуль-таты по образованию или отсутствию зон задержки роста бактерий из биоматериала вокруг лунки [6, 8].

Из данных таблицы 2 видно, что штам-мы-антагонисты (II-10, I2-17, M 22, 10/19, 9/9, 9/2, 8/12, 7/1) вида Bacillus subtilis явля

Таблица 3.

Образцы гелевых пробиотиков

ются активными в отношении ассоциации бактерий из гнойных экссудатов от коров и перспективными для создания комплексного пробиотического препарата для наружного применения.

Дальнейшая разработка гелевой лекарственной формы пробиотиков проводилась в лаборатории технологии лекарственных средств на фармацевтическом факультете ВГМУ. Из института микробиологии НАН РБ были получены кулыуральные жидкости пробиотиков (Bacillus subtilis 9/9 SD, Bacillus subtilis 11-10, Bacillus subtilis 9/9 SD + Bacillus subtilis 11-10).

В качестве подбора ингредиентов было приготовлено около 30 различных составов гелей, которые каждый раз имели какие-либо недостатки (одни составы через некоторое время разжижались, т. е. происходило разрушение геля, в других составах поливиниловый спирт (ПВС) не растворился ни при нагревании на водяной бане в течение 30 минут, ни при добавлении 20 мл воды очищенной и дальнейшем нагревании).

В результате проведенных исследований получены и подобраны три образца наиболее оптимальных составов гелевых пробиотиков, которые отображены в таблице 3.

Полученные образцы гелевых препаратов были подвергнуты исследованию на подавление выделенной микрофлоры из больных коров с гнойно-некротической патологией in vitro.

В результате исследований установлено, что при применении состава 1 (Bacillus subtilis 9/9 SD) и состава 2 (Bacillus subtilis II-10) задержка роста была незначительная или отсутствовала, а состав 3 (Bacillus subtilis 9/9 SD + Bacillus subtilis П-10) вызывал наибольшую задержку роста тест-культур. Состав № 3 в дальнейшем получил свое название «гель Ветоспорин»

Испытание геля «Ветоспорин» на лабораторных животных показало, что отклонений в общем состоянии животных не было как до опыта (температура (°С) - 38,5±1,17; пульс (уд./мин.) - 157,4±0,63; дыхание (в мин.) - 56,3±2,16), так и в конце опыта (температура (°С) - 38,2±1,58; пульс (уд./мин.) -158,7±1,15; дыхание (в мин.) - 57,5±1,62). Вокруг раны в течение трех суток отмечали повышение местной температуры, нарастающую припухлость, гиперемию и болезненность. На 4 сутки в полостях ран произошло нагноение с последующим выделением гнойного экссудата. Для лечения гнойных ран всем 4 кроликам без предварительной хирургической обработки был внесен гель «Ветоспорин», который был выбран на основании предварительных исследований, проведенных in vitro. Гель «Ветоспорин» вносили в раны трехкратно с интервалом 48 часов. В период лечения пробиотиками нами не проводилась хирургическая обработка раны и не использовались другие лекарственные препараты.

На седьмые сутки у всех животных наблюдалось уменьшение воспалительной реакции (слабо выраженное повышение местной температуры и гиперемии, снижение болезненности, незначительное уменьшение припухлости). Наблюдалось снижение выделяемого гнойного экссудата, по краям раны наблюдался рост грануляционной ткани.

На 14 сутки у кроликов отмечалось отсутствие местной температуры, гиперемии, болезненности, в области ран имелась незначительная припухлость. На участках, где были нанесены раны, наблюдали сформированный струп, после снятия которого отмечали полное заполнение раневой полости грануляционной тканью. Гнойный экссудат отсутствовал.

При исследовании периферической крови выявлено содержание: гемоглобина до опыта - 95,8±7,05 и в конце опыта - 105,8±5,02; эритроцитов, соответственно, - 6,98±0,07 и 6,65±0,35; лейкоцитов - 6,58±0,24 и 6,39±0,26; СОЭ - 2,4±0,24 и 1,6±0,24. При изучении лейкограммы в течение опыта отмечено увеличение сегментоядерных нейтрофилов с 36,2±1,02 до 38,4±4,16; моноцитов, соответственно, - с 2,0±0,32 до 3,6±0,24 и снижение эозинофилов с 0,8±0,37 до 0,6±0,24, палочкоядерных нейтрофилов -с 6,8±0,66 до 6,2±1,16 и лимфоцитов, соответственно, - с 50,87±0,92 - 47,2±2,75.

Заключение

В результате исследований был проведен подбор и изучение культуральных взвесей микробов и различных ингредиентов для получения геля «Ветоспорин». Гель «Ветоспорин» обладает выраженным антимикробным действием на все музейные штаммы микроорганизмов, которыми были заражены лабораторные животные. Разработанный состав геля «Ветоспорин» позволяет обеспечить быстрое заживление раны в септических условиях. Механизм эффективного действия геля связан еще и с тем фактом, что пути распространения его антагонистически активных бактерий совпадают с возможными путями распространения инфекции в организме.

Список литературы

1.  Безин, А. Н. Клинико-иммунологический статус и иммунокоррекция при травмах у животных. Дисс. д-ра вет. наук 16.00.05 / А. Н. Безин. - Троицк, 2000. - 300 с.

2.  Веремей, Э. И. Уход за копытцами высокопродуктивного молочного скота. / Э. И. Веремей // - Витебск, УО ВГАВМ, 2006. - 107 с.

3.  Гимранов, В. В. Характер и особенности патологических процессов в области пальцев у крупного рогатого  скота голштино-фризской породы / В. В. Гимранов, Р. А. Утеев, А. Ф. Гилязов // Тр. Кубанского госагроуниверситета. Серия: Ветеринарные науки № 1 (ч. 1). - Краснодар, 2009. - С. 319-320.

4.  Кириллов, А. А. Комплексный способ лечения   коров,   больных   гнойным   пододерматитом   / A.  А. Кирилов // Автореф. дисс. канд. вет. наук. - Санкт-Петербург, 2007. - 16 с. 5.  Никитенко, В. И. Вместо лекарств - бактерии / B.  И. Никитенко // Наука в СССР. - 1991. - № 4. - C.  116-121.

6.  Вспомогательные вещества, которые используются в технологии лечебно-косметических кремов / С. Б. Савицкая, Л. Е. Зарума, Л. Ф. Чалый // Фармацевтический журнал. - 1997. - № 4. - С. 52-56.

7.  Смирнов, В. В. Спорообразующие аэробные бактерии —продуценты биологиче ски активных веществ / В. В. Смирнов, С. Р. Резник, И. А. Василевская // Киев : Наук. Думка, 1982. - С. 94-98.

8.  Чуешов, В. И. и др. Промышленная технология лекарств / В. И. Чуешов // НФАУ, 2002. - 716 с.

Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (14), 2012