РазместитьЗначение разбавления спермы. Разбавление спермы позволяетувеличить объем эякулята и осеменить больше самок, а также сохранить жизнеспособность и оплодотворяющую способность сперматозоидов вне организма.
Требования к средам для разбавления спермы. Для разбавления используют специальные среды, биологические и синтетические. Они должны отвечать следующим требованиям:
поддерживать оптимальное равновесие минеральных веществ, не-обходимых для жизнедеятельности сперматозоидов, и иметь осмотическое давление, равное (изотоническое) крови самца;
предохранять сперматозоиды от температурного шока и предотвращать или ослаблять губительное влияние на них процессов, происходящих в замораживаемой или оттаиваемой сперме:
способствовать сохранению плазматической мембраны и акросомы, препятствовать агглютинации сперматозоидов;
снижать активность метаболических процессов в сперматозоидах при хранении при относительно высоких температурах (4 - 20°С);
защищать сперматозоиды от токсических продуктов, образующихся в процессе метаболизма;
предупреждать развитие микроорганизмов, которые губительно действуют на сперматозоиды и половой тракт самок.
Вещества, используемые для приготовления сред. Для приготовления сред применяют компоненты (реактивы) в заводской упаковке: в стеклянных банках с притертыми пробками (или с корковыми пробками, залитыми сверху парафином), а также в запаянных полиэтиленовых мешочках. На упаковке должна быть этикетка с обозначением на-звания препарата и предприятия, выпустившего реактив, степени чистоты реактива (ЧДА - чистый для анализа, ХЧ - химический чистый) и номера контрольного анализа. Хранят реактивы в шкафах в сухом теп-лом помещении.
Для приготовления сред используют следующие вещества.
Натрия цитрат (Na3C6H5O?-5H2O - трехзамещенный, пятиводный). Белые прозрачные кристаллы или мелкокристаллический порошок, слабощелочного, солоноватого вкуса. Обладает хелатными свойствами (активно связывает ионы кальция и тяжелых металлов и уменьшает содержание их в среде) и понижает набухание и проницаемость мембраны сперматозоидов, предохраняя их от потери электрического заряда и агглютинации: рассеивает жировые шарики в желтке так, что при оценке разбавленной спермы под микроскопом можно наблюдать за отдельными сперматозоидами; вместе с другими компонентами создает необходимое осмотическое давление и рН среды.
Натрия цитрат (Na3C6H5O7-2H2O - трехзамещенный двухводный), идентичен Na3C6H5O7-5H2O.
Калия фосфат (однозамешенный - КН2РО4). Большие прозрачные кристаллы или кристаллический порошок, слабокислый на вкус.
Натрия фосфат (Na2HPO412H2O - двузамещенный двенадцати-водный). Белые крупные кристаллы.
Натрия гидрокарбонат (NaHCO3). Белый порошок, щелочной на вкус.
Магния сульфат (MgSO4-7H2O). Бесцветные кристаллы.
Аммония, сульфат [(NH^SO^. Бесцветный кристаллический порошок, возможен легкий желтоватый оттенок.
Трилон Б (хелатон-3, двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, C10H14OBN2Na2-2H2O). Белые кристаллы; сберегают в темном месте.
Все эти соли подобно натрий цитрату связывают ионы кальция и оказывают благоприятное действие на состояние и целостность мем-бран сперматозоидов, создают необходимое осмотическое давление и рН среды.
Натрия хлорид (NaCl). Мелкокристаллический порошок или таб-летки массой 0,9 г.
Калия хлорид (КС1). Белый мелкокристаллический порошок.
Кислота лимонная (С6Н8О7-Н2О). Белый кристаллический порошок, хорошо растворим в воде.
Трис-буфер (2-ам1шо-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол). Мелко-кристаллический белый порошок. Устойчиво удерживает первоначальную величину рН среды, обладает осмотическим действием, хорошо проникает через клеточную мембрану. Он способен соединяться с FT и СО" и устранять явления дыхательного ацидоза клеток и может заменить в средах глюкозу и натрия цитрат.
Глюкоза (виноградный сахар, C6Hi206H20). Белый гигроскопичный порошок сладкого вкуса.
Фруктоза (гексоза, C6Hi2O6). Белый порошок сладкого вкуса.
Сахароза (тростниковый сахар, С12Н22ОИ). Представляет собой белые кристаллы, сладкие на вкус.
Лактоза (молочный сахар - С12Н22ОП-Н2О). Белые кристаллы или белый кристаллический порошок без запаха, со слабым сладким вкусом, растворимы в воде. Хранят в бытовом холодильнике при темпера-туре 5°С.
Глицин (аминоуксусная кислота, NH2CH2COOH). Белый мелкокри-сталлический порошок, слабого специфического запаха и сладковатого вкуса.
Введение в среды Сахаров пли глицина (гликокола) понижает их электропроводность и защищает сперматозоидов от агглютинации (склеивания их головками или всем телом в результате потери отрицательного электрического заряда).Сахара (глюкоза, фруктоза) могут быть использованы сперматозоидами для метаболических процессов.
Благоприятное действие Сахаров на сперматозоиды связано не только с участием их в метаболических процессах. Сахара являются источником редуцирующих веществ. Воспринимая кислород и окис-ляясь, ош! могут служить антиоксидантами и предохранять антагглютинин и ферменты, содержащие сульфгидрильную группу, от окисления. Сахара увеличивают вязкость среды и препятствуют развитию гнилостных микроорганизмов. Кроме того, они способны задерживать воду или заменять ее в структурах, чувствительных к дегидратации.
Желток куриных свежих (1-2 дня!) яиц. Содержит: глюкозу, которая используется сперматозоидами раньше, чем фруктоза плазмы спермы, различные протеиды, водорастворимые и жирорастворимые витамины, каротин, холестерин и другие вещества, стимулирующие активность дегидрогеназ сперматозоидов. Лецитин желтка защищает сперматозоиды от температурного шока, а ряд других веществ и со-единений могут служить в качестве окислительных субстратов, предохраняющих сульфгидрнльные группы ферментов и антагглютинин от разрушения. Желток имеет слабокислую реакцию (рН 6,0-6,3)-Обычно она нейтрализуется введением в среду лимоннокислого натрия. В среды для спермы быка и барана желтка включают 12,5-20,0%. Оптимальным количеством для спермы хряка и кролика является 3-5%, а для жеребца- менее 1% желтка.
Глицерин (СН2ОН'СНОН-СН2ОН). Простейший трехатомный спирт; представляет собой густую, прозрачную, бесцветную, гигроскопичную жидкость. Легко смешивается с водой или этиловым спир-том в любых пропорциях. При охлаждении до -196°С затвердевает без образования кристаллов льда. Таким же свойством обладают и рас-творы с концентрацией его 70% или более. Точка замерзания растворов даже с небольшим содержанием глицерина понижается, а объем их уменьшается. Введенный в среды для замораживания спермы глицерин уменьшает опасность образования кристаллов льда и механического повреждения ими сперматозоидов, способствует снижению давления на клетки и препятствует сильному повышению концентрации растворенных веществ при образовании кристаллов льда из воды. Глицерин используется сперматозоидами путем окисления для образования энергии, а в аэробных условиях восполняет содержание фруктозы. Вносится он в количестве от 3 до 10 мл на 100 мл среды.
Бактериостатические вещества - пенициллин, стрептомицин, гентомицин, тилозин, линкомицин, спектиномицин. стрептоцид белый растворимый или комбинированные препараты: спермосан-3, спермосан ПГЖ, полиген, комбиспермосан ЛАП и др. Все антибиотики долж-ны быть проверены на безвредность для сперматозоидов.
При хранении спермы возможно развитие в ней микроорганизмов. Попадают они в момент получения или обработки спермы. Размножаясь, микроорганизмы выделяют в среду продукты обмена, которые отрицательно сказываются на выживаемости сперматозоидов. При осеменении внесенные со спермой в половые пути самки микроорганизмы могут препятствовать оплодотворению или развитию беременности. Особенно большую опасность представляет загрязнение спермы возбудителями специфических половых инфекций. Для предупреждения размножения микроорганизмов в сперме и инфицирования спермы вносят сульфаниламиды и антибиотики.
Среды готовят на дистиллированной (желательно дважды дистиллированной) воде. Проводить дистилляцию необходимо в цельно-стеклянном дистилляционном аппарате, чтобы вода не соприкасалась металлическими деталями. Хранят в закрытых стеклянных сосудах.
Среды для разбавления спермы быка. Сперму быка хранят при температуре -19б°С (в жидком азоте), иногда при О..5°С и при комнатных температурах. Разбавляют сперму средами, состав которых зависит от технологии расфасовки и хранения. Многие среды запатентованы.
При замораживании спермы (в гранулах и соломинах) разбавление проводят ЛЖГ (лактозо-лселточно-глицериновоу) средой или ЛЖЦГ (лактозо-желточно-цитратно-глт{ериновоп). В ее составе:
Вода дистиллированная 100 мл 100 мл
Лактоза 11,5 г 10,5 г
Натрия цитрат - 0,2 г
Желток куриных яиц 20 мл 20 мл
Глицерин 5 мл 5 мл
Спермосан-3 50 тыс. ЕД. 50 тыс. ед
Многие организации по искусственному осеменению используют двухфракшюнные среды и сперму разбавляют дважды. Не содержащая глицерина фракция А используется для начального разбавления и охлаждения спермы, вторая фракция Б с удвоенным содержанием глицерина добавляется после того, как сперма охлаждена до +5°С. Введение глицериновой фракции после охлаждения уже разбавленной спермы предотвращает возможные повреждения сперматозоидов и обеспечивает проявление действия антибиотиков. Наиболее простая среда -желточно-цитрато-шщериновая. (ЖЦГ), состоящая из двух фракций:
Фракция А
Цитратный буфер 2,9%-ный 400 мл
Желток свежих (1-2 дня) куриных яиц 100 мл
Фракция Б
Цитратный буфер 330 мл
Желток 100 мл
Глицерин 70 мл
Финальное соотношение фракции А + сперма и фракции В - 1:1. При таком соотношении содержание компонентов (в %) в смеси: буфер цитратный - 73, желток- 20 и глицерин - 7. В эту среду (в одну или обе фракции) можно включать фруктозу или глюкозу; конечная концентрация в среде от 1 до 1,25%. ЖЦГ среда должна иметь рН 6,8— 6,9 и осмотическое давление 285-300 миллиосмомолей.
Медведев Г.Ф. и Гуминская Е.Ю. (2007) предложили модифициро-ванную цитратно-лактоза-желточно-глицериновую среду (ЦЛЖГ). В состав этой среды входят: натрия цитрат 3-замещенный 2-водный (№зС6Н5О7'2Н2О), лактоза (химически чистая С!2Н22ОП'Н2О), желток куриных яиц (1-2 дня) и глицерин.
Фракция А среды
Цитратный буфер с концентрацией 2,9% — 100 мл
Лактоза- 3,58 г
Желток куриных яиц - 25 мл
Смесь антибактериальных веществ — 2 мл
Фракция Б среды
Цитратный буфер с концентрацией 2,9% - 82,5 мл
Лактоза- 3,58 г
Желток куриных яиц - 25 мл
Глицерин - 17,5 мл.
В двух мл стерильного водного раствора антибактериальных веществ должно содержаться 10 мг тилозина тартрата, 50 мг гентамицина и 30/60 мг линкоспектина. Осмотическое давление среды - 335-380 мнллиосмолей, рН 6,9-7,0.
В предыдущие годы широко использовалась молочная среда. Так, в США в 1992 г. 1/4 часть всей спермы была разбавлена молочной средой. Единственный серьезный недостаток этой среды - это наличие оптически различимых жировых шариков, которые затрудняют оценку подвижности сперматозоидов.
Готовят две фракции среды.
Фракция А
Прогретое молоко 500 мл
Фракция Б
Прогретое молоко 430 мл
Глицерина 70 мл
Молочная среда должна иметь рН 6,5-6,6 и осмотическое давление 260-290 среды миллиосмолей.
Сперму быка можно хранить и при температуре +2...5°С в течение 72 ч, разбавив глюкозо-цитрато-желточной средой.
Вода дистиллированная 100 мл
Глюкоза 3 г
Натрий лимоннокислый 1,4 г
Желток куриных яиц 20 мл
Спермосан-3 75-90 тыс. ед.
В США широко использовалась желточно-фосфатная среда:
фосфатный буфер и желток куриных яиц в соотношении 1:1.
Фосфатный буфер (рН 6,7-6,8) содержит в 100 мл дистиллирован-ной воды 0,2 г КН2РО4 и 2,0 г Na2HPO4' 12H2O. Смесь подогревается в кипящей водяной бане до растворения солей. Хранится при темпера-туре 15°С. Перед использованием добавляется необходимое количест-во желтка.
Рекомендуется и другая среда - Cornell University Extender, буфер -80% (объема), желток - 20% (объема), пенициллина - 1000 ед и стрептомицина - 1000 ед.
Натрия .лимоннокислого (Na3C6H;O7 2Н2О) 14,5 г
Натрия бикарбоната 2,1 г
Калия хлорида 0.4 г
Глюкозы 3,0 г
Глицина 9,4 г
Лимонной кислоты 0,9 г
Сульфаниламида (стрептоцида) 3,0 г
Дистиллированной воды до 1 л
В Новой Зеландии широко практикуется хранение спермы в тече-ние трех дней при комнатных температурах (18-24°С). Осеменение скота сезонное - с середины сентября до декабря. Осеменяют ежегодно до 1,8 млн. животных. В 1991 г. спермой быка голштинской породы Crocketts Trevor было проведено в течение трех месяцев 380000 осеме-нений.
Для разбавления спермы используют желточио-цитратную среду, в основу которой положен щггратный буфер. Среду насыщают азотом и добавляют капроновую кислоту.
Натрия лимоннокислого (Na3C6H5O7 2Н2О) 14,5 г
Глюкозы 0,3%
Глицина 1,0%
Глицерина 1,25%
Капроновой кислоты 0.03125%
Сульфацетамида 0,01%
Воды дважды дистиллированной до 100 мл
Желток, пенициллин и стрептомицин добавляют в среду перед ис-пользованием. Содержание желтка после разбавления - 5%. Сперма разбавляется нередко из расчета 2 млн. сперматозоидов в дозе (0,5 мл), но чаще ее расфасовывают в соломины объемом 0.25 мл. Добавление каталазы 20 мкг на 1 мл среды повышает оплодотворяемость на 1-2%. Каталаза разрушает образующуюся в процессе метаболизма сперматозоидов перекись водорода.
Среды для разбавления спермы барана и козла. Для хранения спермы при температуре +2...+4°С в течение одного-двух дней применяют глюкозо-цитрато-желточную среду в составе:
Вода дистиллированная - 100 мл Глюкоза - 0,8 г
Натрий лимоннокислый - 2,8 г Желток куриных яиц - 20 мл Спермосан-3 - 50-75 тыс. ед.
В США для разбавления спермы используют желточно-цитратный
или желточно-фосфатный буфер. Цитратнып буфер готовят из расче-та 36 г трехзамешенного пятиводного (ТЧазСб^Оу^'^О) или 30 г двухводного (Na3C6H5Ov2H2O) цитрата натрия в 1 л дистиллирован-ной (ультрачистой) воды. Фосфатный буфер готовят растворением 2 г Na2HPCvl2H2O и 0,2 г КН2РО4 в 100 мл дистиллированной (ультра-чистой) воды. Раствор стерилизуют и добавляют к нему 20 % (к объе-му) желтка свежего куриного яйца (в момент разбавления спермы).
Замораживание спермы барана практикуется реже, чем спермы быка. Это связано с недостаточно стабильными результатами осеменения маток замороженной спермой, а также с особенностями организации искусственного осеменения в овцеводстве и сроков его проведения. Для разбавления и замораживания рекомендуется ряд синтетических сред.
Состав лактозо-желточноп (ЛЖ) среды
Вода дистиллированная 100 мл
Лактоза 12 г
Желток 20 мл
Состав ЛЖГТЦГ-среды
Лактоза 14,5 г
Гуммиарабик 6,0 г
Желток 20 мл
Глицерин 17,0 мл
Трис-(оксиметил)-аминометан 0,6 г
Лимонная кислота 0,27 г
Спермосан-3 25 тыс. ед.
Вода дистиллированная 100 мл
Состав среды ВИКА
Сахароза 9,84 г
Натрий-кальциевая соль ЭДТА 0,84 г
Желток 10 мл
Глицерин 5,0 мл
Токоферол (25-30%-ный масляный раствор) 2,0 мл пни
Ди-трет-бутил-крезол (ДТБК) 0,05 г
Спермосан-3 25 тыс. ед.
Вода дистиллированная до 100 мл
Состав ГЖУК-трис-буферноп среды
Лактоза 8,4 г
Ксилит 0,26 г
Хелатон-3 0,135 г
Желток 20 мл
Глицерин 6,0 мл
Трис-(оксиметил)-аминометан 0.105 г
Декстрин 5 г
Спермосан-3 илиППК 25 тыс. ед.
Вода дистиллированная 100 мл
Рекомендуется и молочная среда.
Среды для разбавления спермы хряка. Хранят сперму хряка при
температуре +17.. .+18° С в течение 3-10 сут (иногда до 14 сут). Дня этого используют среды для краткосрочного, среднесрочного и долго-срочного хранения (ГХЦС и ГХЦ и таблица 1, 2).
Состав разбавителей ГХЦС и ГХЦ (Киев)
Вода дистиллированная 1000 мл 100 мл
Глюкоза 40 г 60 г
Хелатон 2,6 г 3,7 г
Натрий лимоннокислый 3,8 г 3,56 г
Сульфат аммония 1,8 г —
Натрий двууглекислый 0,5 г 1,2 г
Спермосан-3 250-300 тыс. ед. 250-300 тыс. ед.
Таблица 1. Среды для разбавления и хранения спермы хряка в течение 3-14 дней
Класс разбавителя Название разбавителя Максимальный срок хранения, дней
Кратко-срочный Beltsville Thawing Solution. BTS 3
V.S.P. 3
Модифицированный BTS 3
Средне-срочный Модифицированный Киев
(rXU)/SpermAid 3-5
Modena 3-5
VITAL® 4-5
Merck III™/ Киев/EDTA 4-6
Долго-срочный Модифицированный Modena 5-7
MR-A 6-7
Androhep® 6-7
Androhep®/zte™ 6
Androhep PLUS™ 7
X-CELL™ 7
ACROMAX 7-8
Сверх-срочный Mulberry III 7-14
Таблица 2. Состав разбавителей i juelph и Zorpva для спермы хряка
Компоненты Краткосрочный разбавитель Guelph, г/л Среднесрочный разбавитель Zorpva, г/л
D глюкоза 60.0 11,50
Натрий лимоннокислый трехза-мещенный 3,70 11.65
Di-sodium EDTA Di-sodium ED-
ТА 3,70 2,35
Натрий гидрокарбонат 1,20 1,75
Поливиниловый спирт (тип II) - 1.00
Трис - 5,50
Лимонная кислота - 4,10
Цистепн - 0,07
Пенициллин 500000 Ш 600000 Ш
Стрептомицин 0,5 г 1,0 г
Среды для разбавления спермы жеребца. Для разбавления и хра-нения спермы жеребца при температуре +2...+4°С в течение 48 ч при-меняется лактозо-хелато-цитратно-желточная среда (ЛХЦЖ).
Вода дистиллированная 100 мл,
Лактоза 11,0 г,
Натрий двууглекислый 8,0 г,
Натрий лимоннокислый 89,0 мг,
Хелатон 100 мг,
Желток куриных яиц 1,6 мл,
Спермосан-3 24—30 тыс. ед.
Эта же среда, но с добавлением 3,5 мл глицерина применяется для разбавления и замораживания спермы.
