Метод основан на У-3' экзонуклеазной актин ности термостабильной ДНК-полимеразм <Taq, Tfl) и на флуорогённои олигопуклеотидной ДНК-пробе, способной к флуоресценции при ферментативном гидролизе (TaqMan). Олигоиуклеотнд TaqMan коньюгирован с флуоресцентной меткой и ингибитором флуоресценции. Данный олишнуклеотид специфически гибридизуется с мишенью ДНК или кДНК в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) на каждом её цикле, располагаясь между праймерами для ПЦР, и гидролизуетен при синтезе продукта реакции. При лом флуоресцентная метка количественно высвобождается н свободном состоянии, и уровень флуоресценции измеряется прибором (например Perkin-Llmer AB1 Prism 7700) в реальном времени в ходе ПЦР. При каждом цикле учитывается не сигнал, а увеличение сигнала С(Т), что пропорционально изначальному количеству мишени в исследуемой пробе. После окончания ПЦР полученные данные обсчитываются в сравнении со стандартной кривой, полученной при анализе известных количеств ДНК или РНК-мишени в серии разведений. Разным авторам удалось получить линейную зависимость между С(Т) и количеством мишени в серии от 5 до 8 десятикратных разведений исследуемого образца, в опытах но количественному определению накоплении вируса иммунодефицита кошек IF TV), корон а вируса кошек (FcoV), возбудители инфекционной бурсальнои болезни кур (1BDV), ряда ретровирусов и других объектов (мРНК интерлейкинов). Это позволяет говорить о реальном технологическом воплощении количественной ПЦР. Метол может быть применён ко всем объектам, для выявления которых успешно применяют ПЦР (вирус чумы плотоядные, коронавирус собак, вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней, респираторный коронавирус свиней и многие другие). В области массовой диагностки метод ПЦР- TaqMan очень хорошо зарекомендовал себя, например, при выявлении и дифференциации нести вирусов (вирусов классической чумы свиней, пограничной болезни овец, диареи крупного рогатою скота). К главным преимуществам данного метода относятся: возможность количественной опенки, быстрота, удобство, надежность, воспроизводимость. Отсутствует необходимость в гнездовой двухэтагшой ПЦР и в анализе продуктов после окончания ПЦР, сохраняется возможность проводить обратную гр;шскришшю и ПЦР а одной пробирке. Сохраняются чувствительность и специфичность, присущие методу ПЦР, снижается риск контаминации образцов. Дополнительные расходы на прибор для ПЦР с флуориметром и приобретение пробы TaqMan компенсируются отсутствием приборов для электрофореза и фотографирования гелей, снижением времени реакции, снижением требований к квалификации персонала, увеличением количества анализируемых образцов.
ПРЕИМУЩЕСТВА СОВРЕМЕННОГО МЕТОДА ДНК-ДИАГНОСТИКИ, ОСНОВАННОГО НА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ ЗОНДОМ (TAQMAN)
- Подробности
- Категория: Диагностика