А.Г. ГЛОТОВ, Т.И. ГЛОТОВА, А.В. НЕФЕДЧЕНКО
ИЭВСиДВ

Т. В. ГРЕБЕННИКОВА, Т. И. АЛИПЕР
НПО НАРВАК

Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) относится к числу экономически значимых инфекций. Возбудитель ее пренадлежит к роду Pestivirus семейству Flaviviridae и вызывает у крупного рогатого скота различные клинические формы болезни, которые могут неблагоприятно влиять на каждую стадию производства животноводческой продукции: поражения репродуктивных органов, желудочно-кишечного и респираторного трактов, болезнь слизистых и острые формы инфекции с иммуно-супрессией [3, 4].

В настоящее время известные штаммы вируса подразделяют на 2 биотипа, различающиеся по своему воздействию на культуры клеток: цитопатогенные и нецитопатогенные. Размножение последних не сопровождается видимыми морфологическими изменениями клеток, в то время как первые вызывают быстрое развитие цитопатического действия (ЦПД) и гибель клеток [2]. У вируса выявлены 2 антигенно разные генетические группы (генотипы), в каждой из них есть цитопатогенные и нецитопатогенные штаммы вируса [5].

При проведении массовых эпизоотологических обследований, особенно при скрининге стад крупного рогатого скота на наличие в них персистентно инфицированных животных-вирусоносителей, своевременная точная и объективная диагностика, как составная часть мероприятий по профилактике и борьбе с болезнью, имеет большое значение. Одним из важных диагностических тестов в ветеринарной вирусологии становится полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая по сравнению с традиционными вирусологическими методами имеет преимущества в скорости, чувствительности и специфичности. Метод ПЦР в настоящее время широко используют за рубежом [7, 8]. В НПО НАРВАК разработали "Тест-систему для обнаружения вируса диареи (ВД) крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)" (ТУ 9388-005-42418073 - 04). Она позволяет выявлять штаммы вируса, относящиеся к первому генотипу независимо от биотипа, а также дифференцировать возбудитель ВД-БС КРС от других пестивирусов, в частности от вируса классической чумы свиней (КЧС).

Цель исследований - оценить возможность применения ПЦР для выявления РНК вируса ВД-БС КРС в пробах биоматериала от животных, а также в сравнении с классическим методом выделения вируса в культуре клеток проверить ее чувствительность и специфичность.

Материалы и методы. В эксперименте использовали референтные штаммы вируса ВД-БС КРС первого генотипа: NADL (Национальный институт болезней животных, США), ВК-1 (ВГНКИ ветпрепаратов), Сибирский штамм ТМ-340, а также 7 изолятов вируса, выделенных от больных и инфицированных животных, относящихся к разным биотипам. Исследовали 70 проб биоматериала,    полученного   от   животных (пробы внутренних органов, носовые и вагинальные выделения, сперма).

Подготовку биологических образцов (влагалищные выделения больных коров, кусочки внутренних органов телят, сперма быков-производителей) и последующие вирусологические исследования проводили согласно стандарту МЭБ [6].

Вирус выделяли микрометодом в первично-трипсинизированной культуре клеток тестикул бычка (ТБ) и перевиваемой линии культуры клеток КСТ согласно методике [1]. В качестве ростовой использовали питательную среду Игла MEM с однократным и двойным набором аминокислот и витаминов, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина. Клетки культивировали при 37 °С в присутствии 5 % СО2- Возможную контаминацию культуры клеток вирусом ВД-БС предупреждали, добавляя к ней 5 - 10 % сыворотки крови лошади ("Биолот", Санкт-Петербург). Поддерживающей средой служила та же среда, но без сыворотки.

Вирусы с инфекционной активностью 104 - 106 ТЦЦ50/мл применяли для выделения РНК при помощи неорганического носителя, входящего в комплект тест-системы.

При проведении ОТ-ПЦР использовали тест-систему согласно наставлению по ее применению от 27.07.05. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем этидиум бромид при напряжении 10 В/см. Результаты электрофореза учитывали с помощью трансиллюминатора-UVT-i, просматривая гель в ультрафиолетовом свете (1=254 нм). Положительными считали пробы, в которых визуально детектировали полосу фрагмента ДНК, соответствующую полосе положительного контроля. Каждый образец анализировали трижды.

Результаты исследований и обсуждение. Для определения чувствительности ПЦР в лабораторных условиях контрольный штамм вируса ВД-БС КРС титровали методом десятикратных разведений и амплифицировали. Чувствительность ПЦР составила 0,01 ТЦД50/мл.

Специфичность тест-системы испытали, используя панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованные вирусологическими и иммунохимическими методами.

Из таблицы 1 видно, что отрицательные результаты при проведении ОТ-ПЦР были получены на матрице РНК близкородственного вируса КЧС, а также на матрице нуклеиновых кислот, выделенных из неинфицированных культур клеток. Эти данные подтверждают высокую чувствительность и специфичность разработанной тест-системы на основе ПЦР.

При тестировании штаммов и изолятов вируса ВД-БС первого генотипа, относящихся к разным биотипам, установили, что ПЦР выявляет РНК всех исследованных штаммов и изолятов вируса обоих биотипов, выделенных в культуре клеток и типированных в реакции нейтрализации (табл. 2).

Изучая возможность использования ПЦР для диагностических целей, протестировали 70 проб биоматериала от больных и инфицированных вирусом животных, а также зараженных культур клеток. Параллельно провели выделение вируса (ВВ) в культуре клеток (ТБ).

Таблица 1

Оценка специфичности ПЦР для выявления вируса ВД-БС КРС

Таблица 2

Амплификация РНК штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС

Таблица 3

Сравнение эффективности выявления вируса ВД-БС КРС в пробах биоматериала от животных методами ПЦР и выделением вируса в культуре клеток

Из данных таблицы 3 видно, что, суммарно методом ПЦР выявили на 12,9 % больше положительно реагирующих животных, чем вирусологическим методом. Вирус выделили в культуре клеток из 38,1 % проб биоматериала от телят, в то время как методом ПЦР - из 52,3 %, что на 14,2 % больше. При исследовании проб вагинальных выделений коров и спермы быков-производителей число положительных в ПЦР образцов было соответственно на 5,9 и 20,9% больше по сравнению с таковыми при вирусологических исследованиях.

Результаты двух методов совпали с данными при исследовании культуральной жидкости инфицированных вирусом культур клеток. По-видимому, более высокий процент положительных результатов, полученных в ПЦР по сравнению с таковыми вирусологических исследований, связан с присутствием нецитопатогенных вариантов вируса в пробах биоматериала от животных.

Заключение. "Тест-система для обнаружения  вируса диареи  (ВД)  крупного

рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)", разработанная в НПО НАРВАК, является универсальной, чувствительной и специфичной при исследовании штаммов и изолятов вируса, относящихся к первому генотипу. Она пригодна для рутинных диагностических исследований в региональных лабораториях для выявления вируса ВД-БС КРС в пробах биологического материала разного происхождения, полученного от животных независимо от клинического проявления болезни, и при отсутствии возможности проведения вирусологических исследований. В лабораторных испытаниях чувствительность ПЦР составила 0,01 ТЦД50 /мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Глотоа А.Г. и др, // Вопросы вирусологии.2006, №1.

2. Deregt D. et al. // Can Vet J. 1995. 36.

3. Lindberg A.LE. //VeterinaryQuarterly. 2003, 5,1.

4. Sockett D. etal. Bovine Viral Diarrhea Virus: A 50 Year Review. (Cornell University College of Veterinary Medicine, Ithaca, NY). 1996.

5. Ridpath J.F. et al. // Virology. 1994, 205.

6. OIE Manual 2000, Manual of Standarts, BVD. 2004.

7. Vilcek S. et al. // J.Virol Methods. 2001,92, 1.

8. UrunoK. etal.//J Vet Med Sci. 1998,60,7.

 журнал "Ветеринария" №12 2007