Ротавирусная инфекция лошадей - остро протекающая болезнь, сопровождающаяся острым гастроэнтеритом, диареей новорожденных и лихорадкой. Болезнь распространена во всех странах мира и наносит существенный экономический ущерб.
На данный момент существует несколько методических подходов к диагностике ротавирусной инфекции у животных, но ни один из них не является оптимальным по сумме таких критериев как чувствительность, специфичность, быстрота получения результатов и низкая себестоимость.
Таким образом, целью данной работы являлась разработка тест-системы для экспресс-диагностики ротавирусной инфекции животных с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)
На первом этапе был проведен поиск нуклеотидных последовательностей генома ротавирусов по базам данных Entrez (Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека, Национальный институт здоровья, США), GeneBank, EMBL (Европейская молекулярно-биологическая библиотека) и Япоиской базой данных нуклеотидных последовательностей - DDBJ. Для анализа было отобрано около 300 нуклеотидных последовательностей гена vp7, 100 нуклеотидных последовательностей гена vp6, £0 последовательностей гена nsp4, 18 нуклеотидных последовательностей гена nsp 1, все варианты нуклеотидных последовательностей генов vp1, vp2, vp3, vp4.
На втором этапе было проведено выравнивание отобранных нуклеотидных последовательностей с помощью системы ClastalW Multi Sequnce Alignment с целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков необходимых для выбора праймеров. Данный анализ показал, что большинство генов ротавируса отличаются крайне выраженной вариабельностью и не подходят на роль мишеней для ПЦР-анализа В то же время, нам удалось обнаружить достаточно консервативные районы в области гена NSP4. Однако даже выбранные участки у ряда изолятс = ротавируса, выделенные главным образом от животных, содержали нуклеотидные замены. Поэтом* структура предложенных нами праймеров, была задана так, чтобы наиболее вариабельные поз;- v содержали два наиболее часто встречающихся нуклеотида или, в том случае, если в данном положе-.v равновероятно встречались более двух нуклеотидов, канонический нуклеотид заменялся - = дезоксиинозинмонофосфат.
 
На третьем этапе была изучена специфичность предложенных лраймеров с помощью компьютерных программ FASTA и BLASTA on line. В результате этой работы была показана гомология выбранных олигонуклеотидов только с генами NSP4 ротавирусов и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других групп вирусов, бактерий или последовательностями эукариот Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.
На следующем этапе наших исследований были оптимизированы условия реакции обратной транскрипции и ПЦР и определена чувствительность ПЦР-анализа. Для проведения этих экспериментов была использована РНК, выделенная из штамма ротавируса SV II РНК с известным содержанием вирусных частиц, определенным с помощью культурального метода. Чувствительность методики на препаратах РНК, выделенных с помощью фенол-хлороформной экстракции, была близка к 10 копиям РНКвПЦР-пробе.
Затем мы определили аналитическую чувствительность ПЦР-анализа, используя две методики для выделения РНК - кислотно-фенольная экстракция по Хомчинскому и сорбция РНК на сорбенте из лизата по Boom и соавт.. Для этого были использованы разведения ротавируса: 10, 102, 10 , 1Q4, 105 в 1 г фекалий. Чувствительность первого подхода составила 102 вирионов в 1 г. Чувствительность второго подхода составила 10° вирионов в 1 г Таким образом, методика кислотно-фенольной экстракции оказалась более чувствительной в модельных условиях.
Для сравнения двух методик выделения РНК в фекалиях животных было взято 18 образцов, для которых были получены положительные результаты иммуноферментного анализа. РНК выделяли из 100 мкл фекалий с помощью двух методик, проводили реверсию с помощью рассеянной затравки и ставили ПЦР с выбранными праймерами.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что метод кислотно-фенольной экстракции непригоден для исследования фекалий. Разработанная методика ПЦР для детекции РНК ротавируса в фекалиях, в основу которой положен метод выделения РНК по Boom, дает сопоставимые результаты с ИФА при исследовании положительных проб фекалий, но является в 1000 раз более чувствительной.
Разработанная тест-система прошла успешно комиссионные испытания, утверждена Департаментом ветеринарии и сейчас широко применяется ветеринарными лабораториями РФ
На сегодняшний день лаборатория молекулярной диагностики нашего института проводит целый комплекс диагностических исследований, включающий выявление самого широкого спектра возбудителей бактериальных, вирусных и грибковых инфекций животных.
Отличительной чертой методик, разработанных и применяемых нами для этих целей, является практически полное отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных реакций, Данное достижение стало возможным благодаря введению в практику нашей работы передовых технологий проведения ПЦР-анализа - использованию внутренних стандартов на всех стадиях ПЦР и "стерилизации" реакционных смесей посредством их предобработки ферментом урацилгликозидазой, клонированном в нашей лаборатории. Гарантией качества наших исследований является предоставление отчетов по каждому анализу, выполняемых с помощью системы компьютерного видеодокументирования результатов.