Эпизоотический лимфангит (лимфангоит, лимфангиит) - тяжелое инфекционное заболевание лошадей, распространенное на земном шаре почти повсеместно.
В.Д.Борзионов, В.А.Мищенко, О.И'.Гетманский, ЕТ.Кузнецова
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных, Владимир/Юрьевец
Эпизоотический лимфангит (лимфангоит, лимфангиит) - тяжелое инфекционное заболевание лошадей, распространенное на земном шаре почти повсеместно. На территории бывшего СССР эпизоо¬тии данного заболевания имели место в военные и послевоенные годы (1), По официальным данным эпизоотический лимфангит лошадей (ЭЛЛ) в СССР ликвидирован в 1960 году (2). В то же время заболевание ликвидировано и в большинстве стран мира. Однако в последние годы ЭЛЛ снова зарегистрирован в Италии, Египте, Эфиопии, на Ближнем Востоке, в Монголии, Китае, Корее и Японии {3-9). Нашими исследованиями, начатыми с 1992 года, выявлены ежегодные единичные случаи эпизоотического   лимфангита   в   южных  областях   Республики   Казахстан.  
Эпизоотический лимфангит (ЭЛЛ. африканский сап. ложный сап) - контагиозное хроническое заболевание однокопытных, которое характеризуется воспалением лимфатических сосудов с воз-никновением язв, абсцессов, кератитов и пневмоний. Возбудителем заболевания является микроскопический гриб Cryptococcus farciminosus Rivolta. (Син.: Histoplasmafarciminosus (Rivolta et Micellone) Cifteri et RedaellL 1937), относящийся к классу Ascomycetes и впервые открытый итальянским ученым S. Rivolta в 1873 году. Учитывая высокую устойчивость в окружающей среде, патогенность и способность к быстрому размножению данного микроорганизма, заболевание ЭЛЛ представляет серьезную опасность для поголовья лошадей
Диагностика эпизоотического лимфангита лошадей затруднена. Данное заболевание необходимо дифференцировать от сапа (клиника, маллеинизация, РСК), а также от язвенного лимфангоита (10). Основными методами диагностики заболевания до настоящего времени являются аллергическая проба, микроскопирование гнойных выделений и клиническое наблюдение за животными Современные методы диагностики, в том числе и основанные на использовании ИФА. отсутствуют, В связи с этим целью наших исследований явилась разработка метода иммуноферментного анализа обнаружения антител к возбудителю ЭЛЛ.
Для получения специфического антигена и иммунной сыворотки использовали штамм Cf-96 Cryptococcus farciminosus Rivolta из коллекции ВНИИЗЖ Гриб культивировали на твердых агаризованных и жидких питательных средах. Культивирование на твердых агаризованных средах позволяло нарабатывать большое количество микроконидий, которые использовали для иммунизации животных и получения иммунной сыворотки При культивировании патогена на жидкой питательной среде в основном шло образование мицелиальной формы гриба с небольшим количеством микро- и макроконидий. Мицелий гриба использовали для выделения специфическихгликопротеинов
Для получения гипериммунной сыворотки живые или инактивированные микроконидии гриба, эмульгированные с масляным адъювантом до получения стабильной эмульсии типа «вода в масле», вводили по 1-2 мл в межпальцевые ткани задних конечностей кроликов (по 0,1-0,2 мл в каждую точку инъекции)
Для получения специфической сыворотки живые или инактивированные микроконидии гриба, эмульгированные с масляным адъювантом до получения стабильной эмульсии типа "вода в масле", вводили по 1-2 мл в межпальцевые ткани задних конечностей кроликов (по 0,1-0,2 мл в каждую точку инъекции).
Спустя 28 дней кроликам повторно вводили внутримышечно в области бедра двойную дозу концентрированного очищенного антигена в объеме 2-5 мл, но с добавлением в качестве адъюванта 2,5-5 мг сапонина.
Через 8-10 дней проводили пробное взятие крови для определения активности сыворотки в РДП. Животных обескровливали и получали сыворотку в том случае, если она активна в разведении не ниже 1:32. Сыворотку использовали в качестве исходного сырья для выделения специфического иммуноглобулина. Иммуноглобулины из сыворотки крови выделяли сульфатом аммония с последующей очисткой по Кону. Необходимо отметить, что полученные сыворотка и иммуноглобулины давали перекрестные реакции в иммунологических тестах с антигенами, выделенными из грибов рода трихофитон, микроспорум и аспергиллюс. Поэтому особое внимание было уделено получению специфического антигена из грибов рода криптококк.
Для изготовления антигена из грибов, выращенных способом глубинного культивирования, выделяли гликопротеиновую фракцию
Белок очищали дробным высаливанием сульфатом аммония с последующей хроматографией на сефакриле S-200. Чистота и качество полученных антигенных препаратов подтверждалась элект-рофорезом в ПААГе. Концентрацию полученного препарата определяли спектрофотометрически, з его специфичность - в РДП. Для работы брался антиген с титром не ниже 1:64.
Антиген, нормальная и специфическая сыворотки лиофильно высушивались и использовались в дальнейшем для составления диагностического набора, предназначенного для определения специ-фических антител к возбудителю эпизоотического лимфангита в сыворотках крови лошадей методом иммуноферментного анализа (ИФА). Сущность метода заключается в выявлении комплекса антиген-антитело на поверхности лунок полистиролового планшета, Образовавшийся специфический комплекс взаимодействует с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом против IgG лошади и вызывает разложение субстрата, окрашивая содержимое лунок планшета
Для постановки реакции ИФА использовали планшет, в лунках которого был адсорбирован очищенный антиген. Образцы исследуемых проб сывороток крови разводили 1:100 фосфатно-солевым буфером и перемешивали В лунки рядов планшета В2-В12. . . Н2-Н12 вносили по 0,1 см3 фосфатьс-солевого буфера, в лунки В1, С1 - положительную, а в лунки D1, Е1 - отрицательную контрольные сы¬воротки по 0,2 см3 и проводили раститровку по горизонтальным рядам. Из последних лунок В12 - Е'1 удаляли по 0,1 см"3 разведения сывороток.  Остальные лунки  планшета {ряды А2-А12, F1-F12,  G1-G"Z.
 
конъюгата и субстрата и заполнялись
и Н1-Н12) служили    контролем неспецифического связывания фосфатно-солевым буфером (по 0,1 см3).
1:12800,   то   сыворотку   титровали   по
Если   титр      антител   в   испытуемых   пробах   превышал горизонтальным рядам планшета.
кислоты, 10.0   см3
Планшет осторожно встряхивали, закрывали крышкой и оставляли при температуре 4 - 8°С на 17-18 ч Затем лунки планшета освобождали от содержимого путем встряхивания и трехкратно промывали фосфатно-солевым буфером После этого во все лунки планшета вносили по 0,1 см3 раствора антивидового имуунопе-роксидазного конъюгата против IgG лошади, помещали планшет в термостат на 37±0,5сС на 1 ч. и затем промывали четырехкратно. В дальнейшем во все лунки вносили по 0,1 см3 раствора ортофенилендиамина и оставляли при температуре 18-20°С в темном месте 5-10 мин. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 0,05 см3 раствора серной приготовленного путем растворения 2,0 см3 концентрированной серной кислоты в дистиллированной воды.
Выявление специфических антител в сыворотках крови можно проводить и без раститровки испытуемых сывороток. В этом случае во все лунки планшета А2-А12... Н2-Н12 вносили по 0,1 см3 исследуемых проб сывороток в разведении 1:400, используя по 1 лунке на каждую пробу В три лунки вертикального ряда А1, В1, С1 вносили положительные, в три следующие D1, Е1, F1 - отрицательные контрольные сыворотки в разведении 1:400, а лунки G1, Н1 служили контролем конъюгата и заполнялись по 0,1 см3 раствором фосфатно-солевого буфера. Остальные этапы проводили аналогично описанным выше.
Учет результатов анализа проводили после остановки реакции с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.
Инструментальный фотометрический учет результатов анализа позволяет количественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности (ОП 492 нм). Конечным разведением испытуемой сыворотки считали последнее ее разведение, в котором оптическая плотность превышает таковую отрицательного контроля в 2,0-2,1 раза То есть, о наличии антител к возбудителю ЭЛЛ и, соответственно, наличии заболевания, можно судить по превышению оптической плотности испытуемых проб над таковой отрицательного контроля в 2,0-2,1 раза или по результату раститровки исследуемой сыворотки, титр которой должен составлять не менее 1:400. Данная тест-система прошла аппробацию в Монголии и в южных областях Республики Казахстан. Достоверность постановки диагноза составила 100%
Таким образом, во ВНИИЗЖ разработан достоверный метод диагностики эпизоотического лимфангита лошадей на основе иммуноферментного анализа. Данный метод точен, высокоспецифичен, экспрессен, прост в исполнении и не требует для постановки сложного оборудования. Кроме того, при диагностике ЭЛЛ не требуются естественно восприимчивые и лабораторные животные, что значительно удешевляет диагностику и предотвращает распространение данного заболевания.