РазместитьОпределение содержания отдельных классов липидов после их разделения методом ТСХ имеет ряд преимуществ перед описанным выше: во-первых, позволяет получить более точные данные, и, во-вторых, определение отдельных классов липидов можно автоматизировать и тем самым сократить время исследований.
Принцип. В основе метода лежит адсорбционная хроматография, которая основана на сорбции растворенного вещества твердой фазой — активным сорбентом. Подвижная фаза (растворитель разделяемой смеси веществ) движется по неподвижной фазе (сорбенту), и при этом разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в направлении движения растворителя. В качестве сорбента для разделения липидов и фосфолипидов чаще применяют силикагель — соединение с общей формулой S1O2 • «Н2О. Адсорбирующие свойства силикагеля объясняются наличием группы — SiOH—, имеющей свободные водородные связи. Присутствие моно- или мультимолекулярных слоев адсорбированной воды ухудшает разделяющие свойства силикагеля. Поэтому нагревание (активирование) пластинки с силикагелем при 100—115 вС для удаления воды повышает разделяющую способность силикагеля.
Метод ТСХ позволяет разделить сложные смеси липидов на тслассы: фосфолипиды, моно-, ди- и триацилглицерины, НЭЖК, холестерин свободный и этерифицированный; в свою очередь, фосфолипиды на подклассы, фосфатидилхолин (лецитин), фосфа-тидилэтаноламин и т. д. и тем самым упрощает и повышает точность количественного определения отдельных классов и подклассов липидов, а также их выделение для дальнейшего изучения.
Разделение общих липидов на классы методом ТСХ включает следующие операции: приготовление тонкого слоя силикагеля на стекле; активизация его, нанесение общих липидов на тонкий слой; разделение липИдов в системе растворителей; проявление и идентификация отдельных классов липидов; их количественное определение.
Реактивы: силикагель для ТСХ с величиной частицы" 10—40 мкм, приготовленный путем измельчения отечественного гранулированного силикагеля марки КСК, или силикагель марки ЛС 5/40 (Чехия), или аналогичных марок других фирм;
петролейный эфир с точкой кипения 40—60 °С;
диэтиловый эфир (лучше для наркоза) с точкой кипения 35—36 °С;
уксусная кислота ледяная;
—хлороформ перегнанный;
йод кристаллический;
5— 10%-ный раствор фосфоромолибденовой кислоты или 10—15%-ный водный раствор серной кислоты;
свидетели—соединения отдельных классов липидов: фосфолипидов, триацилглицеридов, НЭЖК, холестерина свободного и этерифицированного. В качестве таковых используют лецитин яичного желтка, трипальмитат или триолеат, пальмитиновую или другую жирную кислоту, холестерин и холестерин-эфир любой кислоты. (3—5%-ной концентрации в хлороформе, ч. д. а.).
Оборудование (по Шталю): станок для фиксации плас-тинок, представляющий собой гладко выструганную доску длиной 100—120 см, шириной 20,7 см с гладкими бортиками по краям и высотой 1,5—2 см. В начале и конце станка также устанавливают бортики-ограничители. Перед работой плоскость станка покрывают на всю длину полиэтиленовой пленкой;
металлический аппликатор, позволяющий наносить слой сили-кагеля нужной толщины, который изготавливают из цельнометаллического прямоугольного бруска нержавеющей стали (он представляет собой как бы ящик без дна 19 х 5 см по внешним
метрам). Сверху с обеих торцевых сторон бруска оставляют специальные выступы для удобства его захвата при работе. Аппликатор плотно прилегает к поверхности стекла, но его задняя стенка имеет зазор (щель) высотой 3—5 мм, толщина которой регулируется закрепляющейся на винтах подвижной пластинкой (шторкой);
пластинки стеклянные 20 х 20 или любого другого размера; кассета для сушки и хранения готовых пластинок; стеклянная ка-мера (прямоугольник или круглая) с притертой крышкой для хроматографии; сушильный шкаф; эксикатор; микропипетки на 0,1 мл и более; пульверизатор.
Ход определения. Приготовление тонкого слоя и нанесение липидов. Хорошо вымытые, обезжиренные стеклянные пластинки закладывают в станок. На старт и финиш станка кладу пластинки шириной не более 5—6 см. Все стекла еще раз протирают хлороформом. На старт помещают аппликатор с предварительно отрегулированной шириной зазора (250—300 мкм для разделения липидов на классы и 350—500 мкм для разделения фосфолипидов на подклассы), обращенного к переднему концу станка.
В коническую колбу вместимостью 150—200 мл отвешивают силикагель (из расчета 5 г на одну пластинку 20 х 20 см) и заливают двойным объемом дистиллированной воды, закрывают пробкой и энергично встряхивают 90 с до получения однородной массы (без^ пузырьков), затем быстро выливают в аппликатор и непрерывным плавным движением прибора наносят слой силикагеля на стеклянные пластинки. Слой должен быть гладким, без пустот и наплывов.
Пластинки оставляют на ночь при комнатной температуре, а перед использованием их помещают в сушильный шкаф на 1—2 ч при ПО °С для активизации. После охлаждения пластинки с нижнего края ее на 0,3—0,5 см удаляют силикагель, а на 1^1,5 см вы^ ше иглой намечают линию старта.
Пробы липидов наносят (осторожно!) микропипеткой или микрошприцем с иглой в виде отдельного пятна или полосы шириной 1—1,5 см. Расстояние от краев стекла составляет 2 см, а между пробами 2—3 см. Рядом с пробой наносят раствор каждого свидетеля в отдельности или их смесь.
Приготовление хроматографической камеры и подвижной фазы. Дно и внутренние стенки покрывают чистой фильтровальной бумагой и смачивают подвижной фазой, в которой будет проводиться разделение липидов. Это создает хорошее насыщение камеры парами подвижной фазы, что улучшает разделение. Подвижную фазу наливают в камеру в таком объеме, чтобы хорошо пропиталась фильтровальная бумага и на дне был слой толщиной 1—1,2 см. Камеру закрывают прошлифованной крышкой и ставят под вытяжной шкаф (все делается под вытяжным шкафом!).
В качестве подвижной фазы используют ряд смесей
Состав подвижных фаз объем/объемп соотношениев них отдельныхкомпонентов
КомпонентПодвижные фазы
1 2 3 4 5 6
Петролейный эфир Скип 40-60 °С)
Диэтиловый эфир (tKm 36-37 "С)
Гексан 85 15 80 20 82 18 90 10 85 30 70
Ацетон Уксусная кислота ледяная 1 1 1 3 15 2
После того как хроматографическая камера насытится парами подвижной системы (10—20 мин), в нее вносят пластинку с нане-сенными липидами, которую ставят вертикально или с небольшим наклоном (около 60е) к стенке камеры. В прямоугольную камеру ставят 2 пластинки в виде буквы V. Камеру быстро закрывают и оставляют при комнатной или пониженной температуре на 40—45 мин. Как только граница подвижной фазы достигнет ли^ нии, расположенной на 1 см ниже верхнего края (финиша), пластинку быстро извлекают и в горизонтальном положении подсушивают 10—15 мин под вытяжным шкафом.
Для проявления липидов отдельных классов пластинки спрыс-кивают из пульверизатора водным раствором серной кислоты или спиртовым раствором фосфоромолибденовой кислоты и прогревают в сушильном шкафу при 180—200 °С до обугливания. Липиды разных классов выступают в виде черных пятен. В этих случаях липиды отдельных классов (кроме фосфолипидов) разрушаются. Чтобы обнаружить липиды без разрушения, чаще используют пары йода. Несколько кристалликов йода насыпают в стеклянный бюкс, вносят несколько капель спирта и помещают в эксикатор. После того как произойдет некоторая возгонка йода, в эксикатор вносят пластинку силикагелем вниз и крышку плотно закрывают. Через 10—15 мин липиды выступают в виде ярко-желтых или коричне-вых пятен. Пластинку вынимают, пятна отводят иглой и после ис-парения йода (под вытяжным шкафом) их соскабливают и переносят в пробирки для количественного определения.
Анализ классов липидов можно проводить без экстракции рас-творителем в присутствии силикагеля, используя вышеизложен-ные химические методы исследования. Но перед определением оптической плотности содержимое пробирок центрифугируют для осаждения силикагеля. При необходимости экстрагировать липиды от силикагеля используют метанол для фосфолипидов и хлороформ для ацилглицеринов, НЭЖК и холестерина.
При использовании подвижных фаз 1 и 3 классы липидов рас-полагаются в одной, а при использовании фазы 5 — несколько в другой последовательности (табл. 25).
25. Значение Rf для отдельных лшшдных классов при использовании разных нодвижных фаз
Фазы 1 и 3
Фаза 5
Класс липидов
Липиды сыворотки крови
Липиды печени
Липиды сыворотки крови
Фосфолипиды 0,00 0,00 0,00
Моноаиилглинерины 0.04 — 0,02
Диацилглицерины 0,08 0,08 0,40
Холестерин свободный 0,11 0,12 0,21
НЭЖК 0,20 0,23 0,07
Триацилглицерины 0,44 0,42 0,63
Холестерин этерифициро-ванный 0,70 0,70 0,81
Для детектирования липидов отдельных классов на хроматогра-фической пластинке в качестве свидетелей используют чистые препараты отдельных липидов. При отсутствии свидетелей можно пользоваться коэффициентом подвижности отдельных классов —
Rf. Для его расчета замеряют общую длину разгонки на пластинке (от нижней до верхней границы), которую принимают за 100 %, а затем замеряют местоположение отдельных классов (по центру пятна), рассчитывают их прохождение в процентах относительно всей длины разгонки и сравнивают с литературными данными. На всех подвижных фазах фосфолипиды остаются на старте (на месте нанесения), а самым верхним классом являются эфиры холестерина. Для разделения фосфолипидов на подклассы используют то же" оборудование и тот же принцип приготовления тонкого слоя, как описано выше, но слой должен быть толще — 400—500 мкм. Это связано с тем, что для количественного определения индивидуальных фосфолипидов по фосфору необходимо наносить на пластину несколько больше липидов (5—10 мг).
В качестве подвижной фазы для разделения фосфолипидов методом одномерной хроматографии чаще всего используют подвижные системы, состав которых представлен в таблице 25а.
Концентрированный раствор липидов (5—10 %) наносят на пластину в виде полосы шириной 1,5—2 см или более. Разгон фосфолипидов занимает около 1 ч. После подсушивания пластины проводят детектирование и идентификацию отдельных подклассов фосфолипидов в парах йода или путем опрыскивания его 10%-ным раствором серной кислоты с последующим прогреванием в сушильном шкафу. Обугливание органической части молекулы отдельных фосфолипидов не влияет на количественное определение фосфора, выполняемое химическим путем.
Состав подвижных систем:
хлороформ-метанол-вода, 65 : 25 : 4;
хлороформ-метанол-32,5%-ный раствор аммиака, 70 : 30 : 5;
хлороформ-метанол-вода, 70 : 30 : 5.
Идентификацию индивидуальных фосфолипидов проводят с помощью свидетелей или по величине Rf в сопоставлении с литературными данными (табл. 25а).
25а. Значение величины Rf для фосфолипвдов при разделении их в разных системах
Подклассы
Подвижные системы
Фосфатидиловая кислота
Цереброзиды
Кардиолипин
Фосфатидилэтаноламин
Фосфатидилинозитол
Фосфатидилхолин
Фосфатидилсерин Сфингомиелин Лизолецитин Старт
0,87
— 0,64 (0,55) 0,79
0,77 0,55 0,84
0,52 0,45 0,58
0,40 0,11 0,20
0,27 0,36 0.33
0,21 0,06 0,10
0,17 0,18 0,20
0,08 0,11 0,15
0,0 0,0 0,0
Значительную помощь в идентификации отдельных фосфоли-пидов оказывают специальные реакции. Так, фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин обнаруживаются после опрыскивания раствором нингидрида; 3 г нингидрида растворяют в 5 мл лутидина (2,6-диметилпиридин) и добавляют 95 мл н-бутанола, насыщенного водой. Появляется малиновая окраска, характерная для аминогрупп.
Фосфолипиды, содержащие холин (фосфатидилхолин, лизо-фосфатидилхолин и сфингомиелин), окрашиваются в оранжевый _Цвет_реактивом Драгендорфа, который готовят из двух растворов: раствор I содержит 1,7 г В1(ЬГОз)з • 5НгО в 100 мл 20%-ного рас^ твора уксусной кислоты; раствор П содержит 40 г KI в 100 мл воды. Пластинки опрыскивают смесью, состоящей из 4 мл раствора I и 1 мл раствора II с добавлением 20 мл воды.
Фосфатидилинозитол окрашивается в коричневый цвет амми-ачным раствором серебра, который состоит из равных объемов 0,1 н. раствора AgNC>3 и 1 н. раствора NH3.
Количество индивидуальных фосфолипидов после ТСХ определяют по содержанию в них фосфора по методике, описанной выше для фосфолипидов.
Поскольку фосфолипиды разных подклассов содержат неоди
наковое количество фосфора, их соотношение в исследуемых ма^
териалах выражают в мкг (мг) или в процентах неорганического
фосфора по отношению к его содержанию в общих фосфолипидах.
