Мифтахутдинов А. В.
ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины», г. Троицк Адрес: 457100, Челябинская область, г. Троицк, ул. Гагарина, 13

Введение

Стрессы в птицеводстве являются актуальной проблемой и приводят к снижению воспроизводительных качеств родительского стада и продуктивности. Иммунная система наиболее чувствительна к различного рода стрессам. В результате ее разбалансировки снижается естественная резистентность птицы к различным заболеваниям и эффективность вакцинаций [6]. Стрессы приводят к девиантному поведению кур, нарушению иерархии соподчинения в стаде, расклеву и каннибализму, что что вызывает в свою очередь развитие болезней, повышенную выбраковку родительского поголовья и снижение продуктивности.

Несмотря на высокий уровень однородности кур одной линии или кросса, у них имеются существенные отличия в поведении, связанные с наследственными особенностями нервно-эндокринной системы. Под воздействием социальных условий среды эти отличия могут проявляться в различной устойчивости к стрессам, общей резистентности и продуктивности.

Стрессовая чувствительность сельскохо-зяйственных животных и птиц, по нашему мнению, может быть определена как разный уровень саморегуляции и самоорганизации функциональных систем, где функции и свойства у положительно и отрицательно реагирующих особей будут избирательно отличаться, влияя на полезный приспособительный результат, который оказывается более или менее полезным для жизнедеятельности и реализации продуктивности.

Способы определения стрессовой чувствительности птиц

Существуют различные способы определения стрессовой чувствительности у птиц, условно их можно разделить на прямые и косвенные. К прямым способам можно отнести метод наблюдения и определение в крови уровня стрессовых гормонов -АКТГ, катехоламинов и глюкокортикоидов. К наиболее распространенным косвенным методам относятся тесты, основанные на определении величины соотношения гетерофилов и лимфоцитов крови, изучение миграционной активности лейкоцитов [3], методы моделирования локального адаптационного синдрома путем внутрикожного введения различных раздражающих веществ [4, 5].

Указанные методы имеют свои преимущества и недостатки, поэтому очень важно определить перспективы использования выбранного теста, целесообразность применения того или иного метода в эксперименте и в условиях промышленного производства.

Метод наблюдения является самым простым и самым неточным вследствие субъективности оценки и отсутствия строгих критериев отбора птицы. В условиях эксперимента он может быть использован как уточняющий, в практических условиях его использование затруднено, поэтому он требует более тщательной проработки и конкретизации условий отбора.

К прямым методам можно отнести определение в крови уровня стрессовых гормонов - АКТГ, катехоламинов и глюкокортикоидов. Концентрация кортикостерона в крови птиц является объективным показателем стресса [8].

Определение в крови стрессовых гормонов является самым точным и наиболее сложным методом в плане технического исполнения, материальных затрат и интерпретации результатов. Поэтому различные модификации данного метода широко используются в экспериментальных исследованиях, но в условиях промышленного производства его использование затруднено.

К наиболее распространенным косвенным методам относятся тесты, основанные на определении величины соотношения гетерофилов и лимфоцитов крови, которые коррелириют с уровнем АКТГ и кортикостерона в крови. Соотношение гетерофилов и лимфоцитов (Г/Л) крови является более стабильным показателем стресса птиц, чем концентрация гормонов, бифазная клеточная реакция является уникальной для класса птиц. При воздействии сверхпороговых раздражителей, в опасных для жизни ситуациях Г/Л не всегда может приниматься как точный показатель стрессового воздействия у птицы [8].

Метод определения миграционной активности лейкоцитов (МАЛ) периферической крови основан на капиллярном способе в модификации Ю. И. Забудского с соавт. (2002) [3]. По сообщениям авторов-разработчиков, метод характеризуется высокой точностью, однако высокая трудоемкость, техническая сложность не позволяют использовать указанный метод в условиях производства.

По нашему мнению, у методов, основанных на взятии крови и последующего анализа, имеется важный недостаток - трудоемкость и необходимость метить каждую экспериментальную птицу, что не позволяет использовать эти методы и в условиях научно-производственных опытов, где ведется индивидуальный или групповой учет. Поэтому основным применением этих методов становятся эксперименты с ограниченным количеством особей в группе в условиях лаборатории или вивария. Бондаренко Г. М. (2004) разработан способ определения стресс-чувствительности цыплят и кур ремонтного молодняка по определению биологического потенциала. К стрессустойчивым относят ремонтный молодняк с показателями БИП (мкА или мкВ) выше (+1 сигма), к стресс-чувствительным относят особей с БИП ниже (-1 сигма) от средних значений конкретной популяции [1].

Метод имеет преимущество вследствие того, что можно тестировать цыплят раннего возраста, однако сами авторы указывают, что светимость и фазы Луны оказывают влияние на биоэлектрические показатели. Эти факторы необходимо учитывать при постановке пробы, а это в условиях производства и даже научного эксперимента не всегда осуществимо и может прямым образом сказаться на результатах тестирования.

Метод моделирования локального адаптационного синдрома путем внутрикожного введения различных раздражающих веществ [4, 5]. Авторы метода предлагают для оценки стрессовой чувствительности применять в качестве раздражителя чистый скипидар или в разведении 1 : 4, формалин или сок каланхоэ, которые при внутрикожном введении вызывает яркий локальный адаптационный синдром в форме асептического воспаления участка кожи и окружающих тканей. Кичеева Т. Г. (2002) предлагает для кур родительского стада внутрикожное введение в область бородки сока каланхое. Метод позволяет более точно провести отбор стресс-устойчивых кур в раннем возрасте. Точность способа, по данным автора, составляет 98,6 %.

Указанный способ имеет важные преимущества, позволяющие использовать его в условиях промышленного производства и научных исследованиях. Не требует специальных приборов и навыков для проведения пробы, отбор птиц можно проводить во время учета реакции. Основным недостатком метода является то, что постановка реакции и снятие результатов являются сильным стресс-фактором для птиц. Однако для научных исследований этот недостаток можно использовать для моделирования искусственного острого стресса кур.

Несмотря на перспективность обозначенного метода, его использование ставит ряд вопросов, касающихся достоверности получаемых данных. Для изучения достоверности метода нами проведены экспериментальные исследования, заключающиеся в оценке воспроизводимости полученных данных при двукратном тестировании стрессовой чувствительности и сравнительный анализ с наиболее точными маркерами стрессового воздействия на организм птиц - концентрации плазменного кортикостерона и адреналина и величины соотношения гетерофилов к лимфоцитам.

Материалы и методы

Эксперименты проводили в условиях ЗАО «Уралбройлер» Аргаяшская птицефабрика на курах мясного направления продуктивности кросса ISA F15 и петухах М99. На фабрике применяется напольная система содержания.

Для проверки объективности получаемых данных и степени выраженности общего адаптационного процесса мы провели сопоставительный анализ классических методов оценки стрессовой чувствительности кур и показателей, характеризующих развитие адаптационных реакций разного уровня. Методологической основой исследований послужила теория «Неспецифических адаптационных реакций организма», разработанная Гаркави Л. X., Квакиной Е. Б., Кузьменко Т. С. [2].

Тестирование и отбор кур по степени стрессовой чувствительности проводили путем внутрикожного введения 70%-го раствора скипидара в область бородки и оценки результатов реакции по степени выраженности локального адаптационного синдрома. Учет местной реакции проводили через 24 часа по наличию или отсутствию признаков воспаления.

На первом этапе исследований была проведена оценка стресс-чувствительности 1600 голов птиц родительского стада в возрасте 48 недель. Через 24 часа после воздействия, во время учета реакции, кур и петухов делили на 2 группы: положительно реагирующие и отрицательно реагирующие, птиц с сомнительным результатом реакции в опытные группы не включали. Формирование групп осуществляли согласно чувствительности, отрицательно реагирующих кур с отрицательно реагирующими петухами и положительно реагирующих кур с положительно реагирующими петухами. Всего в каждой группе было по 330 голов, 30 петухов и 300 кур. Наблюдение за птицей осуществляли в течение 28 суток при достижении курами возраста 52 недель.

На втором этапе для оценки стабильности реакции и моделирования технологического стресса проводили повторную реакцию у опытного поголовья. Из групп удаляли сомнительно реагирующих особей, а также особей, у которых осуществляли взятие крови и различные функциональные пробы. В результате на втором этапе каждая группа включала 297 птиц - 270 куриц и 27 петухов. Наблюдение осуществляли 28 суток при достижении курами возраста 56 недель.

Достоверность полученных результатов пробы оценивали путем двукратного проведения теста с интервалом 28 суток и сопоставления результатов.

Для проверки объективности получаемых данных и был проведен сопоставительный анализ классических методов оценки стрессовой чувствительности кур и показателей, характеризующих развитие адаптационных реакций разного уровня [2].

Для оценки общего напряжения и стадии адаптационного процесса использовали концентрацию уровней адреналина, кортикостерона в плазме крови и анализ лейкограммы.

Взятие крови осуществляли через 30 минут после проведения скипидарной пробы, по данным Moneva P. and all (2009), в указанный промежуток времени отмечается наивысшая концентрация кортикостерона в плазме кур после воздействия.

Математически по лейкограмме определяли соотношение количества гетерофилов и лимфоцитов (Г/Л) [3, 9]. В плазме крови определяли уровень адреналина и кортикостерона методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа.

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Statistica 6.1. Цифровые данные представлены средней арифметической и средним квадратичным отклонением. Уровень значимости был принят равным 0,05.

Результаты и обсуждение

В результате оценки скипидарной пробы птиц родительского стада через 24 часа после проведения реакции определили, что у 1072 голов была выражена отрицательная реакция, у 360 голов - положительная и у 168 голов - реакция характеризовалась как сомнительная, что составляет 67, 22,5 и 10,5 % соответственно. После проведения повторной пробы кур с уже известной стресс-чувствительностью через 28 суток после начала эксперимента обнаружили, что большинство особей реагировали адекватно степени стрессовой чувствительности, сомнительная реакция наблюдалась у 5 особей из группы отрицательно реагирующих и у 7 особей из группы положительно реагирующих, что составляет 1,8 %. Следовательно, можно констатировать, что специфичность метода для кросса ISA F15 и М99 в условиях напольного содержания составляет 98,2 %.

В исследованиях как зарубежных, так и отечественных авторов убедительно доказана роль различных катехоламинов (адреналина, норадреналина, дофамина) в механизме развития стресса. В покое количество адреналина и кортикостерона в плазме кур с разной стрессовой чувствительностью не имеет достоверных отличий. Через 30 минут после воздействия происходит резкое повышение уровня гормонов: у стресс-устойчивых (отрицательная реакция) кур уровень адреналина с 11,79±4,15 нг/мл в состоянии относительного покоя до 60,77±18,83 нг/мл через 30 минут после проведения скипидарной пробы, у стресс-чувствительных (положительная реакция) - соответственно с 9,35±0,80 нг/мл до 152,58±76,85 нг/мл. То есть у кур с отрицательным типом реакции на внутрикожное введение раствора скипидара увеличение концентрации произошло в среднем в 5,2 раза, у кур с положительным типом реакции - в 16,3 раз. Такие же изменения наблюдаются при анализе плазменных концентраций кортикостерона: у стресс-устойчивых кур с 33,88±4,47 нмоль/л в состоянии покоя до 81,22±39,23 нмоль/л -через 30 минут после проведения скипидарной пробы и у стресс-чувствительных -с 33,59±8,60 до 131,96±49,75 нмоль/л, то есть в 2,4 и 3,9 раз соответственно.

Наблюдаемый выброс стрессовых гормонов в кровь указывает на высокую реактивность как стресс-чувствительных, так и стресс-устойчивых кур. Уровень реактивности определяется вовлечением в развитие реакции разных систем организма: сначала системы «блуждающий нерв - инсулин», затем - симпатико-адреналовой системы и системы «гипофиз - кора надпочечников» и, наконец, системы «блуждающий нерв - глюкагон». При нарушении регуляции или истощении этих систем могут наблюдаться различные эффекты, проявляющиеся снижением секреции катехоламинов и глюкокортикоидов, либо наоборот чрезмерной активации нервно-эндокринной системы.

Повышение гормонов в крови стресс-чувствительных кур более выражено, что, с одной стороны, говорит о более высокой степени стрессирования, с другой стороны, о том, что реакция протекает на высоком уровне реактивности. Стресс-чувствительные куры адекватно реагируют на раздражители, и у них отсутствует истощение гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, характерное для хронических стрессов.

При стрессе происходит быстрая мобилизация наличных резервов организма. Этому содействует и быстрый выброс адреналина, и повышенная секреция АКТГ и глюко-кортикоидов, причем энергия образуется не только наиболее эффективным путем -окислительного фосфорилирования, но и путем гликолиза и даже путем распада белков, РНК и липолиза. Такая неэкономная трата резервов целесообразна при ответе организма на сильный раздражитель, т. к. помогает выжить. Если действие стрессора продолжается или стрессор был очень сильным, наступает истощение резервов. В этой стадии распад преобладает над синтезом, постепенно используются наличные резервы, не пополняясь, и истощаются функциональные. Значительно большая активация нервно-эндокринной системы стресс-чувствительных кур по сравнению со стресс-устойчивыми может указывать на более высокие энергетические траты организма и, как следствие, снижение продуктивности.

Доказано, что глюкокортикоиды влияют на секрецию специфических белков и изменяют электрический потенциал нейронных клеток через механизмы, которые пока остаются необъясненными. Глюкокортикоиды имеют ключевую регулирующую роль в управлении активностью гипоталамо-гипофизо-надпочечной оси и в завершении ответа на стресс, действуя на экстрагипоталамические регулирующие центры, такие как гипоталамус и гипофиз. Описанный механизм через цитокины может способствовать подавлению репродуктивной функции на нескольких уровнях. Эти эффекты проявляются прямо и косвенно, активизируя гипоталамный невральный цикл, в котором секретируется специфические пептиды при увеличении уровня глюкокортикоидов. Наблюдаемые более высокие уровни кортикостерона в плазме крови стресс-чувствительных кур по сравнению со стресс-устойчивыми может косвенно указывать на более высокую степень стрессового повреждения в том числе и репродуктивной системы, имеющей определяющую роль в условиях промышленного содержания родительского поголовья кур.

По сообщениям многочисленных зарубежных исследователей, тонус гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы при развитии стресса отражает показатель Г/Л, который является маркером степени стрессового повреждения. В таблице 1 представлены результаты анализа лейкограмм.

После проведения пробы происходят выраженные изменения в лейкограмме, характеризующиеся отсутствием базофилов в группе стресс-чувтсительных кур, снижением лимфоцитов, повышением гетерофилов; необходимо отметить, что выраженность этих изменении выше в группе стресс-чувствительных кур.

Таблица 1. Лейкограмма кур

Таблица 2. Показатели продуктивности кур с разной стрессовой чувствительностью

Примечание: разность между стресс-чувствительными и стресс-устойчивыми достоверна: * - при Р < 0,05; **-Р<0,01; ***_р<0,001.

Учитывая, что по Гаркави Л. X., Квакиной Е. Б. (1998) в основе приспособительной деятельности организма лежит количественно-качественный принцип, также учитывая дискретность в смене адаптационных реакций, описанные изменения у стресс-чувствительных и стресс-устойчивых кур характерны для стадии ориентировки стресса, однако степень выраженности изменений имеет отличия.

Динамика базофилов и эозинофилов у кур при состояниях функционального напряжения, адаптации и стрессе в настоящее время мало изучены и для объективного анализа требуют отдельного глубоко изучения. Отсутствие базофилов в группе стресс-чувствительных кур предположительно может указывать на потерю ими зернистости вследствие резкого выброса гистамина и других биологически активных веществ, у стресс-устойчивых кур число базофилов несколько увеличивается, что может являться косвенным признаком начала адаптационного процесса.

Оценивая изменения показателя Г/Л, который является стабильным показателем стрессированности птиц, можно отметить, что данный показатель изменяется в зависимости от степени стрессовой чувствительности: у стресс-чувствительных после проведения пробы показатель становится выше, чем у стресс-устойчивых, что также указывает на более выраженную стрессовую реакцию.

Описанные выше механизмы развития стрессов находят подтверждение при анализе продуктивности кур с разной стрессовой чувствительностью. За 56 суток наблюдений продуктивность отрицательно реагирующих кур выше, чем положительно реагирующих, что подтверждается данными, представленными в таблице 2.

Продуктивность стресс-чувствительных кур вначале эксперимента находилась на уровне средней продуктивности в птичнике, в отличие от отрицательно реагирующих кур, интенсивность яйцекладки которых была выше. Средняя яйценоскость опытных кур на втором этапе эксперимента соответствует средней продуктивности стада в анализируемом птичнике.

Сравнивая показатели продуктивности кур с разной стресс-чувствительностью, необходимо отметить, что разница в количестве снесенных яиц на первом этапе эксперимента составляет 14,2 %, на втором этапе разница сокращается до 2,9 % и межгрупповые отличия к окончанию эксперимента становятся недостоверны. Выход инкубационных яиц равен во всех группах, однако несколько выше в группе отрицательно реагирующих кур. На первом этапе эксперимента у положительно реагирующих кур больше яиц с деформацией на 31 %, на втором этапе число яиц статистически равно и разница сокращается до 20 %. При этом разница сокращается за счет статистически значимого снижения показателя положительно реагирующих кур (Р=0,02) на 7,2 %. Средний вес яиц кур с разной степенью чувствительности к стрессам статистически равнозначен. Оплодотворенность яиц положительно реагирующих кур была ниже на 1 и 2 этапах эксперимента на 12,9 %, выводимость ниже на первом этапе на 3 %, на втором этапе эксперимента показатели оказались статистически равнозначны. Вывод яиц от положительно реагирующих кур ниже на 15,6 % на первом этапе и на 12,7 % на втором этапе эксперимента.

Физиологические особенности стресс-чувствительных кур обуславливает более низкую яичную продуктивность, оплодотворяемость яиц и вывод цыплят из яиц, что может быть связано, с одной стороны, с особенностями поведения, с другой стороны, с более высокой активностью гипоталамо-гипофизо-надпочечной системы в реализации стрессовой реакции.

Заключение

Оценка стрессовой чувствительности кур методом моделирования локального адаптационного синдрома путем внутрикожного введения 70%-го раствора скипидара является объективным тестом, позволяющим с точностью 98,2 % проводить отбор в условиях промышленного производства. Проведение скипидарного теста является для кур раздражителем, обуславливающим развитие стрессовой реакции, проявляющейся изменением маркеров стрессового воздействия -плазменной концентрации адреналина, кортикостерона и отношения гетерофилов к лимфоцитам. Оценка состояния гипоталамо-гипофизо-надпочечной системы через 30 минут после внутрикожного введения раствора скипидара указывает на большую активизацию стрессового ответа у стресс-чувствительных кур по сравнению со стресс-устойчивыми, на что указывает и более высокий показатель соотношения гетерофилов к лимфоцитам. Стресс-устойчивые куры по сравнению со стресс-чувствительными обладают более полезным комплексом хозяйственно-полезных признаков.

Список литературы

1.  Бондаренко, Г. М. Изучение влияния светимости и фазы Луны при рождении на адаптационные способности кур по поведению в суточном цикле / Г. М. Бондаренко, М. В. Михайлов // 16 международная научно-практическая конференция «Циклы природы и общества» : [материалы]. - Ставрополь, 2008. - С. 128-130.

2.  Гаркави, Л. X. Антистрессорные реакции и активационная терапия / Л. X. Гаркави, Е. Б. Квакина, Т. С. Кузьменко. - М. : Имедис, 1998. - 565 с.

3.  Забудский, Ю. И. Современные методы диагностики состояния стресса у сельскохозяйственных птиц / Ю. И. Забудский // Третья международная ирано-российская конференция «Сельское хозяйство и природные ресурсы» : [материалы]. - М., 2002. - С. 134-135.

4.  Кичеева,  Т.  Г.  Способ определения стресс-устойчивости кур в раннем возрасте. Патент на изобретение РФ № 2174752 / Т. Г. Кичеева. - 2001.

5.  Кузнецов, А. И., Сунагатуллин Ф. А. Способ определения стрессовой чувствительности свиней. Патент на изобретение СССР № 1653680 / А. И. Кузнецов, Ф. А. Сунагатуллин. - 1991.

6.  Фисинин, В. И. Инновационные методы борьбы со стрессами в птицеводстве / В. И. Фисинин, Т. Папазян, П. Сурай // Птицеводство. - 2009. - № 8. - С. 10-14.

7.  Beuving,   G.   Adrenocortical   and   heterophil/ lymphocyte responses to challenge in hens showing short or long tonic immobility reactions / G. Beuving, R. B. Jones, H. J. Blokhuis // British Poultry Science. - 1989.-№30.-P. 175-184.

8.  Edens, F. W. Adrenal responses in high and low ACTH response lines of chickens during acute heat stress / F. W. Edens, H. S. Siegel // Gen. Сотр. Endocrinol. - 1975. -№25. -P. 64-73.

9.  Gross,   W.   B.   Evaluation   of the   heterophil/ lymphocyte ratio as a measure of stress in chickens / W. B. Gross, H. S. Siegel // Avian Diseases Oct-Dec - 1983.-27 (4).-P. 972-9.

10. Murrani,    W.    K.    Heterophil    lymphocyte ratio   as   a   selection   criterion   for   heat   resistance in  domestic  fowl / W.  K.  Murrani,  H.  Z.   al-Sam, A. M. al-Athari // British Poultry Science. 1997. -№ 38. - P. 159-163.

журна "Актуальные вопросы ветеринарной биологии" № 3 (11), 2011