Ерохина И. А.

Мурманский морской биологический институт КНЦ РАН, г. Мурманск 

Введение

Клинико-биохимический анализ обычно начинается с определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови. Потребность установления его концентрации во многом обусловлена той многообразной и важной физиологической ролью, которую играют белки в организме. Благодаря им поддерживается вязкость, текучесть крови, формируется ее объем в сосудистом русле, а форменные элементы удерживаются во взвешенном состоянии. Белки плазмы осуществляют транспорт многочисленных экзо и эндогенных веществ, участвуя в связывании гормонов, минеральных компонентов, липидов, пигментов и других биологически важных соединений. Будучи амфотерными электролитами, они играют важную роль в регуляции кислотно-основного состояния организма, являются факторами свертывания крови, антителами. Поэтому изменение их содержания в крови приводит к нарушению гомеостаза и специфической реактивности организма. Представление об уровне общего белка в плазме крови позволяет сделать более информативной трактовку протеинограммы - картины разделения белков по фракциям. Соотношение белковых фракций в плазме крови можно определять различными методами: осаждение нейтральными солями, электрофоретическое фракционирование, иммунологические методы, седиментационные методы, осаждение белков охлажденным этанолом (по Кону), хроматография, фильтрация через гели [4]. В клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений наиболее распространен электрофоретический метод исследования, основанный на том, что в электрическом поле белки плазмы крови движутся по смоченному буфером носителю со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки плазмы крови разделяются обычно на пять основных фракций: альбумин и альфа-1-, альфа-2-, бета-, гамма-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии. Более простой в исполнении и не требующий специального оборудования метод исследования белкового спектра плазмы крови - осаждение нейтральными солями. Этот метод базируется на способности растворов солей (сернокислого аммония, сернокислого и фосфорнокислого натрия и других) разных концентраций осаждать отдельные белки плазмы крови. Содержание белка в каждой из полученных фракций определяется либо турбидиметрическим, либо колориметрическим методом. Путем вычитания полученных значений абсорбции в дальнейшем находят концентрацию соответствующих фракций. Для диагностики заболеваний внутренних органов большое значение имеет комплексная оценка изменений всех выявляемых белковых фракций.

В течение многих лет в лаборатории морских млекопитающих Мурманского морского биологического института КНЦ РАН (ММБИ) изучается клеточный и химический состав крови ластоногих в естественной среде обитания и при содержании в неволе. В результате этих исследований мы получили обширный материал, позволяющий в определенной степени судить о связи отдельных показателей крови с физиологическим состоянием животных. В данной работе предпринята попытка обобщить данные о белковом составе плазмы крови тюленей в норме и при различных патологических состояниях и оценить возможность использования этого показателя в практике профилактики и лечения экспериментальных животных.

Материалы и методы

Материалом исследования служила плазма крови нескольких видов арктических ластоногих. Животных обследовали в природных условиях во время экспедиций, а также при содержании на экспериментальном полигоне ММБИ в Кольском заливе. Кровь брали из экстрадуральной вены, как описано в работе [11]. Плазму отделяли центрифугированием и в ней определяли содержание общего белка (биуретовый метод) [4] и распределение его по фракциям. Последний показатель в разные годы был получен с использованием двух методов: электрофорез на бумаге [4] и нефелометрический метод, основанный на осаждении белков растворами нейтральных солей [8]. Статистически достоверных различий между данными, полученными с использованием двух вышеупомянутых методов, не отмечалось. На этом основании в настоящее время в наших исследованиях применяется нефелометрический метод, поскольку он не требует специального оборудования, прост в исполнении и позволяет получить результат в течение 1 часа. Цифровой материал обработан статистически с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

При использовании протеинограмм плазмы крови животных с диагностическими целями необходимо располагать нормальными значениями соотношения белковых фракций, учитывая при этом естественные факторы, вызывающие изменения состава крови. Одним из таких факторов является возраст животных. Исследования возрастных изменений содержания в плазме крови белка и его фракций проводились нами у гренландских и серых тюленей.

Содержание общего белка с возрастом, как правило, увеличивается [10, 14]. Концентрация белка у взрослых гренландских тюленей достоверно (р<0,001) выше, чем у щенков (110,09±5,33 г/л против 78,38±2,59 г/л) (табл. 1). Общей закономерностью, наблюдаемой у различных видов животных, является и возрастное перераспределение белка по фракциям [6, 13], причем уровень альбумина несколько снижается по причине уменьшения использования белка для пластических процессов и снижения интенсивности синтеза альбумина в печени. При этом относительная концентрация глобулинов плазмы крови с возрастом увеличивается, что может быть связано с понижением скорости распада глобулинов у взрослых животных. В таблице 1 видно, что в плазме крови взрослых особей повышение уровня общего белка происходит главным образом за счет Р-глобулиновой фракции.

К естественным изменениям соотношения белковых фракций плазмы крови можно отнести и такие, которые происходят в пределах ответной реакции организма на стрессирующие воздействия. Для морских млекопитающих, как и для других животных, стресс-фактором является пленение, транспортировка и помещение в искусственные условия. В ММБИ постоянно содержатся в неволе разные виды ластоногих, в связи с чем мы располагаем данными об изменении состава крови у них на разных этапах содержания в неволе [2]. Динамика концентрации белка плазмы и его фракций у гренландского тюленя в первые дни содержания в неволе показана на рисунке 1. Содержание общего белка находится в пределах 77,37-89,93 г/л, что показано и для других видов ластоногих [10]. Значительная часть белка (до 75 %) представлена альбумином. В связи с этим и белковый коэффициент (А/Г) у изученных животных довольно высок. При наблюдении за животными в неволе наиболее значительные изменения отмечены в содержании гамма-глобулинов, что,

Рис. 1. Динамика содержания общего белка и его фракций в плазме крови щенков гренландского тюленя в первые дни содержания в неволе.

в первую очередь, указывает на напряжение защитно-приспособительных сил организма. К концу периода наблюдения уровень этих белков возрастает в среднем в 4 раза. Аналогичные результаты были получены и при исследовании китообразных — дельфинов-афалин [3].

Таблица 1. Содержание общего белка и распределение его по фракциям в плазме крови тюленей разного возраста

Примечание: п - количество животных; знаком «*» обозначены статистически достоверные различия по сравнению с показателями новорожденных животных; в скобках указана степень достоверности различий по сравнению с предыдущим возрастом.

По поводу степени увеличения содержания гамма-глобулинов в крови следует отметить работу [5], в которой приводятся данные о том, что у здоровых дельфинов-афалин, содержащихся в неволе, уровень иммуноглобулина G, составляющего основную часть этой фракции, повышается примерно на 80 %. Другие белковые фракции в меньшей степени подвержены изменениям в период адаптации к неволе, как показывает наше исследование и подобные работы с китообразными [3].

Влияние питания на белковый состав плазмы крови животных подтверждается исследованиями биохимического статуса тюленей с различными нарушениями процесса молочного вскармливания [1]. Аномальное течение лактационного периода, когда ощенившиеся самки в силу каких-то физиологических и патологических причин совсем бросают кормить детенышей или когда детеныши получают недостаточное количество молока в течение лактационного периода, приводит к появлению так называемых щенков-заморышей. По содержанию общего белка между нормальными щенками и заморышами не обнаружено статистически достоверных различий. Однако распределение белка по фракциям у обследованных животных неодинаково, о чем свидетельствуют протеинограммы, полученные методом электрофореза на бумаге (рис. 2).

В группе нормальных щенков обнаружен один тип протеинограмм (рис. 2а). Среди заморышей только 20 % имели протеинограммы, близкие к нормальной. Остальные были сгруппированы нами по признаку характерных отклонений от нормального соотношения белковых фракций, которые выражаются в следующем:

значительное уменьшение содержания альбумина и большая выраженность фракции а-глобулинов (рис. 2б);

значительное увеличение содержания альбумина наряду с понижением уровня а-глобулинов (рис. 2в);

значительное повышение содержания у-глобулинов, умеренное понижение содержания а-глобулинов (рис. 2г);

значительное увеличение содержания альбумина и в той же мере уменьшение содержания а-глобулинов, умеренное повышение уровня Р- и у-глобулинов (рис. 2д).

Рис. 2. Типы протеинограмм, встречающихся у нормальных щенков (а) и заморышей (б, в, г, д) гренландского тюленя (п = 16, 10, 4, 9, 1 соответственно). Стрелками показаны направление и степень выраженности изменений в содержании отдельных белковых фракций у заморышей по сравнению с нормальными щенками.

В процентном выражении среди обследованных заморышей преобладают особи с 1 и 3 типом протеинограмм (34 % и 32 % соответственно). Крайне редко (в 2 % случаев) встречается 4 тип протеинограмм.

Следует отметить, что у заморышей, явно истощенных особей, сопутствующая этому состоянию гипопротеинемия наблюдается только у 42 % обследованных животных. Этот факт наводит на мысль о наличии в организме заморышей патологических процессов, которые не связаны непосредственно с недостаточностью питания. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что у отдельных внешне нормальных щенков и взрослых особей встречаются аномальные протеинограммы, сходные с таковыми у заморышей. Не исключено, что недокорм матерью не является единственной причиной аномального состояния заморышей. Щенки могут иметь врожденные отклонения в развитии в условиях загрязнения среды обитания, а также поражаться болезнетворными агентами в первые дни и недели жизни.

Распределение белка плазмы крови по фракциям (протеинограмма) является важным диагностическим показателем. Исследование количественных взаимоотношений между отдельными белковыми фракциями позволяет выявить и дифференцировать заболевание даже тогда, когда содержание общего белка, которое само по себе является важным клиническим признаком, оказывается неизменным [4]. Как и другие клинические биохимические методы, этот используется как для постановки диагноза, так и для изучения тяжести и динамики патологического процесса [7, 12]. Существует перечень типов протеинограмм, соответствующих определенным видам заболеваний внутренних органов человека (табл. 2). Применительно к морским млекопитающим оценка протеинограмм при обследовании животных пока еще не является широко распространенной. В большинстве публикаций, посвященных анализу биохимических компонентов крови тюленей и дельфинов, можно встретить «усеченный вариант» протеинограммы — содержание альбумина и суммы глобулинов. Этот вариант имеет право на существование, поскольку соотношение альбумин/глобулины (альбумин/глобулиновый коэффициент) рассматривается как интегральная оценка протеинограмм [4]. Однако для уточнения диагноза рекомендуется определять соотношение глобулиновых фракций. В руководстве по клинической патологии морских млекопитающих [9] приводится толкование изменений в уровне белковых фракций (табл. 3). Представленные в таблице 3 данные дают самое общее представление о реакции отдельных белковых фракций на различные формы патологии. Отсутствие детализации объясняется в значительной степени тем, что морские млекопитающие до сих пор еще остаются группой животных, недостаточно изученной с точки зрения биохимии и физиологии. Результаты лабораторных обследований больных животных крайне разрозненны, неполны и противоречивы.

Можно сказать, что данное направление исследований еще находится на этапе сбора информации. Однако уже сейчас отметим, что закономерности изменений белкового состава плазмы крови морских млекопитающих в ответ на действие различных факторов сходны с таковыми, установленными для наземных млекопитающих и человека, что облегчает интерпретацию результатов исследования морских животных.

Имеющиеся у нас данные в некоторой степени дополняют известные факты о связи белкового состава крови морских млекопитающих с различными видами заболеваний (табл. 4). Судя по приведенным результатам, изменения соотношения

белковых фракций являются неспецифической реакцией на заболевание, и при констатации данного факта требуется дополнительное лабораторное обследование с применением специфических тестов, характеризующих состояние отдельных органов и систем организма. Например, определение билирубина, мочевины, активности трансаминаз, щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтрансферазы - для оценки состояния печени, определение креатинина, мочевины, электролитов (натрий, калий, кальций, фосфор, хлориды) - для оценки состояния почек и т.п.

Таблица 2. Типы протеинограмм, соответствующие определенным видам заболеваний внутренних органов человека (по: [4])

Таблица 3. Изменения относительного содержания белковых фракций плазмы крови в связи с патологическими состояниями организма (по: [9])

Таблица 4. Содержание белка, соотношение белковых фракций и альбумин/глобулиновый коэффициент (А/Г) крови ластоногих с различными заболеваниями

Примечание: вскрытие погибших животных и постановка патанатомического диагноза выполнялись ветеринарным врачом, к.б.н. Елфимовой Т. Б.

Заключение

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что у морских млекопитающих, так же как и у наземных, соотношение основных белковых фракций в плазме крови изменяется под влиянием естественных и патологических причин. В последнем случае направление и степень выраженности изменений может использоваться с диагностической целью с учетом следующих замечаний:

определение соотношения белковых фракций плазмы крови должно проводиться регулярно в процессе диспансеризации с учетом индивидуальной нормы животных;

протеинограмма плазмы крови является неспецифическим показателем здоровья и должна использоваться, наряду с другими подобными тестами, в оценке состояния организма животных на уровне «норма - патология». При отклонении протеинограммы от «нормальной» должны назначаться дополнительные тесты с учетом характера вышеупомянутых отклонений.

Список литературы

1.  Ерохина, И. А. Влияние недоедания в период молочного вскармливания на биохимические параметры плазмы крови щенков гренландского тюленя Phoca groenlandica / И. А. Ерохина // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 2002. - Т. 38. - № 2. - С. 153-155.

2.  Ерохина, И. А. Состав и свойства белков сыворотки крови щенков гренландского тюленя Pagophilus groenlandicus в период адаптации к неволе / И. А. Ерохина, Н. Н. Кавцевич // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1998. - Т. 34. - № 6. - С. 654-660.

3.  Каганова, Н. В. Изменение показателей белкового обмена в крови черноморских дельфинов-афалин в период послеотловной адаптации / Н. В. Каганова, Ю. В. Наумова // Морские биотехнические системы : Сб. научных статей. - Севастополь, 2002. - Вып. 2. - С. 182-187.

4.  Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Т.  1. — Минск : Беларусь, 2000. - С. 214-257.

5.  Кирюхин, И. Ф. Некоторые характеристики иммуноглобулина G сыворотки крови черноморских дельфинов афалин / И. Ф. Кирюхин, О. Г. Косик // Тез. докл. IX Всес. совещ. по изучению, охране и рациональному использованию морских млекопитающих (9-11 сен.1986: Архангельск). -Архангельск, 1986. - С. 187-188.

6.  Ларина, Е. В. Возраст и обмен белков / Е. В. Парина. - Харьков : Изд-во Харьковского ун-та, 1967. — 204 с.

7.  Сапожников, А. Ф. Гематологические, биохимические и патоморфологические изменения при алеутской болезни норок / А. Ф. Сапожников, В. А. Разницина, А. С. Куликова // Вопросы прикладной экологии (природопользования), охотоведения и звероводства : Матер, науч. конф., 27-28 мая 1997 г. [посвящ. 75-летию ВНИ- ИОЗ им. Б.М.Житкова] - Киров, 1997. - С. 322-323.

8.  Справочник специалиста ветеринарной лаборатории / Под ред. Ю. П. Смияна. - Киев : Урожай, 1987. - С. 294-295.

9.  Bossart, G. D. Clinical pathology / G. D. Bossart, T. H. Reidarson, L. A. Dierauf, D. A. Duffield // Handbook of marine mammal medicine. 2nd Edition. - CRC Press, Boca Raton, Florida, 2001. - P. 383-436.

10. Engelhardt,  F.  R.   Haematology  and plasmachemistry   of   captive   pinnipeds   and   cetaceans   / F. R. Engelhardt // Aquat.Mammals. - 1979. - V. 7, N. l.-P. 11-20.

11. Geraci, J. R. Functional hematology of ringed seals (Phoca hispida) in the Canadian Arctic / J. R. Geraci, T. G. Smith // J. Fish. Res. Board. Can. - 1975. - V. 32, N. 12.-P. 2559-2564.

12. Lastras, M. E. Effects of sarcoptic mange on serum proteins and immunoglobulin G level in chamois (Rupicapra pyrenaica) and Spanish ibex (Capra pyrenaica) / M. E. Lastras, J. Pastor, I. Marco, M. Ruiz, L. Vinas, S. Lavin // Vet. Parasitol. - 2000. - V. 88. - N. 3-4. - P. 313-319.

13. Salatka, K. Rat serum proteins changes with age / K. Salatka, D. Kresge, J. Harris // Exp. Gerontol. - 1971. - V. 6. - P. 25-36.

14. Sepulyeda,M. S. Age-related changes in hematocrit, hemoglobin,   and  plasma  protein  in  Juan  Fernandez fur seals (Arctocephalus philippii) / M. S. Sepulyeda, H. Ochoa-Acuna, B. L. Homer// Mar. Mammal Sci. -1999. - V. 15, N. 2. -P. 575-581.

Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 1 (1), 2009