РазместитьН. Ковал юк, канд. биол. наук,
зав. лабораторией биотехнологии СКНИИЖ,
проректор Краснодарского регионального института агробизнеса,
В. Сацук, канд. с.-х. наук,
директор 000 ИПСХП «Астер»,
Е. Мачульская,
младший научный сотрудник лаборатории биотехнологии СКНИИЖ
ДНК - обязательный компонент любого живого организма (исключение составляют лишь РНК- содержащие вирусы на определенных стадиях своего существования). У мыши и человека, кишечной палочки и слона ДНК устроена по одному принципу - это полимерная макро-молекула, состоящая из звеньев - нуклеотидов. Нуклеотиды бывают 4 видов: А, Т, G и С. У всех живых существ А, Т, G, С-нуклеотиды встречаются в составе ДНК, но в различных комбинациях. Чем ближе друг к другу виды расположены на эволюционной лестнице, тем сильнее похожи их последовательности ДНК, в то же время даже у представителей одной семьи можно найти такие участки ДНК, которые будут строго индивидуальны.
Использование этого биологического свойства легло в основу метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), который, по оценке американского журнала «Science», является самым выдающимся открытием последних лет.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод копирования участка ДНК, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную индивидуальную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 миллионов раз. Некоторые области применения ПЦР - выявление вирусных и бактериальных патогенов и высокоэффективный анализ вариаций нуклеотидных последовательностей (В. И. Глазко и др., 2000; Р. А. Волкова и др., 2000; А. А. Прий-мак, 1995).
Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь с длительным латентным периодом, поражающая органы кроветворной системы (А. П. Кузнецова, В. П. Смирнов 1998).
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является этиологическим фактором (первопричиной) лейкоза у коров, телят, реже у других животных: овец, коз и кроликов (Л. Б. Прохватилова и др., 2001; Н. В. Замараева, М.И. Гулюкин, Н.Н. Снежков, 1996; С. Olson et al., 1981). Имеются данные об эксперимен-тальном заражении обезьян (Н. М. McClure, М.Е. Killing, P. Ph. Custer, 1974). Передача ВЛКРС восприимчивому крупному рогатому скоту может осуществляться со всеми секрета-ми и экскретами при попадании в них лимфо-цитов, зараженных ВЛКРС. Установлено, что для экспериментального заражения телят до-статочно ввести им внутрикожно 2500 лимфоцитов крови от зараженного животного (такое количество лимфоцитов содержится, примерно, в 0,0005 мл цельной крови). Среди основных факторов, обусловливающих передачу вируса лейкоза, наибольшее значение имеет перенос возбудителя через кровь и препаратов из нее, при ветеринарных и зоотехнических обработках, т. е. ятрогенный способ передачи инфекции (В. М. Авилов, В. М. Нахмансон, 1995).
В сперме инфицированных быков-производителей ВЛКРС не выявлен. Не наблюдается определенного влияния передачи ВЛКРС потомству от серопозитивных быков-производителей при естественном оплодотворении серонегативных коров. Однако у быков с воспалением генитальных органов в сперме могут быть лимфоциты, инфицированные ВЛКРС. Экспериментально установлено, что коров можно инфицировать путем нанесения таких лимфоцитов на слизистую оболочку матки. Изучение возможности передачи вируса лейкоза при эмбриопересадках подтвердило отсутствие передачи ВЛКРС от коров-доноров коровам-реципиентам через эмбрионы (Апалькин В. А., Гулюкин М.И., Петров Н.И., 2005).
Вирус лейкоза крупного рогатого скота от-носится к семейству ретровирусов (в это же семейство входят родственные ВЛКРС вирусы Т-клеточного лимфолейкоза и ВИЧ). Ретровирусным инфекциям свойственен ряд общих признаков: длительность инкубационного периода, хроническое или латентное течение, пожизненное вирусоносительство и строго ограниченный круг восприимчивых животных (Б. Г. Орлянкин, 1996; П. Н. Смирнов, В. В. Храмцов, В. В. Смирнова, 2000).
Ретровирусы проникают в клетку, РНК освобождается и превращается в двухцепочечную ДНК - копию, которая встраивается как про-вирус в ДНК клетки хозяина (Б. Г. Орлянкин, 1996). Встроенный в геном хозяина провирус остается не доступным для воздействия специфических антител и в организме на протяжении всей жизни животного.
В благоприятных условиях встроенный провирус формирует новые вирионы, которые отпочковываются от клеточной мембраны для инфицирования новых клеток.
Для диагностики лейкоза применяют кли-нический, патологоанатомический, гистологический, гематологический, серологический и молекулярно-биологический методы.
Все разнообразие клинических признаков лейкоза можно подразделить на специфические и неспецифические.
Большинство исследователей указывают на первичное появление неспецифических признаков, а затем появляются специфические, по которым можно поставить диагноз (Н.В. Румянцева, Т. М. Шатерникова, 1963; Г. А. Симонян, 1963; Э. М. Ным и др., 1970). По мере развития заболевания у отдельных животных развивается понижение реактивности, вялость. Сравнительно рано у больных лейкозом животных регистрируют нарушение сердечно-сосудистой деятельности (глухие тоны сердца, иногда их раздвоенность), пульс слабого наполнения, возможна аритмия. К числу неспецифических признаков лейкоза относятся нерегулярная жвачка, поносы, запоры.
Специфические клинические признаки характеризуются прогрессирующим увеличением поверхностных (околоушных, подчелюстных, предлопаточных, коленной складки, надвыменных), а также внутренних лимфатических узлов, экзофтальмии. (В. М. Лемеш и соавт., 1987).
Гематологический метод позволят диагностировать лейкоз на более ранних стадиях развития заболевания. Сущность его заключается в обнаружении в периферической крови повышенного числа лейкоцитов (в основном лимфоидного ряда), слабо дифференцированных клеток, а также полиморфных, атипичных клеток кроветворных органов (Б. Г. Панков, 1980; М. И. Гулюкин и др., 1996). Для оценки результатов исследований в различных странах предложено несколько вариантов «лейкоз-ных ключей». В нашей стране в 1965 году был разработан отечественный «лейкозный ключ». Все димфоидные диагностические «ключи» ос-нованы на количественных показателях.
Заражение животных ВЛКРС сопровожда-ется выработкой антител к структурным белкам вируса. Антитела и вирус циркулируют в организме у зараженных животных на протя-жении всей жизни. Это позволяет применять серологические методы для диагностики инфекции, вызываемой этим вирусом (Т. С. Кос-тенко и др., 1989; А.Г. Берзяк, B.C. Ковалючко, В. С. Гротевич, Л. И. Киричук, 1990).
Однако, как и любой диагностический ме-тод, РИД не лишен недостатков.
Так, наличие у лейкоза латентной стадии, когда в крови отсутствуют антитела к вирусу, усложняет диагностику заболевания. Экспериментально установлено, что после заражения скрытый период инфекции (период от момента заражения до появления антител к вирусным антигенам) продолжается от 2 недель до нескольких месяцев, поэтому, постепенно выводя из стада РИД-позитивных животных, теоретически возможно добиваться полного оздоровления хозяйства от лейкоза (A. Burny, Bruck С, Cleuter Y., 1985). Тем не менее в оздоровленных стадах, не имевших контактов с другими, через несколько месяцев или даже лет выделяют животных с антителами к ВЛКРС (В.М. Нахмансон, 1986). Это можно объяснить характерным для лейкоза явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования. Иммунологическая толерантность - это частичная или полная утрата способности организма вступать в иммунную реакцию со специфическим анти-геном.
При лейкозе КРС состояние толерантности может развиваться в случае внутриутробного заражения плода инфицированными лимфоцитами матери в период до проявления иммунной компетенции, то есть, в первые 3 месяца развития эмбриона; у отдельных животных, например, у глубоко стельных коров, когда иммуноглобулины накапливаются в секрете молочной железы, и т. д. Кроме того, бывают случаи серо-негативности при наличии сопутствующих инфекций, например, вирусной диареи (В. А. Белявская и др., 2003).
Метод непрямого иммуноферментного анализа (ИфА), основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров, обладает значительно большей чувствительностью, по сравнению с РИД, позволяет автоматизировать процесс, то есть уйти от субъективной оценки результатов реакции. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в молоке и моче (Н.Т. Джапаралиев, Л. Б. Прохватилова, А. И. Ломакин, П. К. Аянот, 2000; К. Т. Carli, et al. 1993; К. Т. Carli, Sen A., H. Batmaz, Е. Kennerman, 1999). Несмотря на очевидные достоинства, достоверность ИФА все же связана с иммунологическими реакциями и поэтому не всегда адекватна.
В связи с изложенным выше, с целью ускорения полного оздоровления стад КРС от лейкоза, целесообразно совместно с РИД и непрямым ИФА использовать методы, выявляющие непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных.
Перспективной в этом плане является полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Мальцева Н. А. и др., 2004). Этот метод позволяет выявлять провирусную ДНК или вирусную РНК в образце крови животного. Анализ литературных данных позволяет расположить методы диагностики лейкоза в порядке возрастания чувствительности, точности и специфичности в следующий ряд: РИД < ИФА < ПЦР
В настоящее время широкое применение метода ПЦР в диагностике лейкоза, на наш взгляд, сдерживается следующими факторами: высокой стоимостью оборудования и реактивов для ПЦР, отсутствием на рынке сертифицированных диагностикумов и не до конца осознанным местом ПЦР-диагностики в системе противо-лейкозных мероприятий.
Важно понимать, что ни один из существу-ющих методов не лишен недостатков. Так, ряд авторов D. Beier, P. Blankenstein,, H. Fechner, (1992); P. Blankenstein, H. Fechner, A. Looman, A. Beier, A. Marguardt, D. Ebner (1998) сообщают, что довольно часто выявляется несоответствие результатов ПЦР и РИД: ПЦР-позитивные особи выявляются среди РИД-отрицательных животных, а ПЦР-негативные - среди РИД-позитивных.
Вполне вероятно, что, несмотря на очень высокую чувствительность ПЦР, в развитии лейкозного процесса бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. В таких случаях РИД оказывается более информативна. Поэтому имеет смысл «дочищать» ПЦР-, РИД- и ИФА-негативных животных, при таком комбинированном использовании диагностических методов гарантировано быстрое и эффективное оздоровление стада.
Учитывая то, что ПЦР обеспечивает выяв-ление непосредственно провируса, то есть, результат анализа не зависит ни от возраста, ни от состояния животного, этот метод можно использовать для разделения телят на инфицированных и здоровых в возрасте до 5 месяцев, то есть до того момента, когда использовать РИД нет смысла. Обнадеживающие результаты получены В. В. Макаровым, Д. П. Гринишиным (2005), которым удалось доказать, что использование комбинированной РИД/ПЦР диагностики более чем в два раза ускоряет процесс оздоровления стада от лейкоза, чем использование только РИД-диагностики.
Важной областью применения ПЦР является исследование импортированного скота, на-
Таблица
Данные об инфицированности животных ВЛКРС в различных хозяйствах
Название хозяйства Исследовано образцов крови Возраст животных ПЦР"+" результаты, %
«Дружба» Калининский район 35 3-4 мес. 25,7
«Бейсуг» Пр.-Ахтарский район 70 2-3 года 58,6
«Дружба» Пр.-Ахтарский район 50 3-4 года 72,0
СЗАО СКВО Рост, область 117 3-4 года 0
ЗАО «Суворова» Пр.-Ахтарский район 121 3-4 года 47,9
ОАО «Племзавод «Кубань» 354 3 года 0,004
«Привольное» Каневского р-на 90 3-6 мес. 44,5
ЗАО «Племзавод Гульксвичский» 48 3-4 года 58,3
«Урожай» Каневского р-на 12 3-4 года 25,0
ООО «Животноводческий комплекс «Ольгинский» 97 1-5 лет 32,9
Учхоз «Краснодарское» 19 3-5 лет 100,0
ходящегося в карантине, с целью предотвращения завоза ВЛКРС из одной страны в другую.
Таким образом, возможны, по крайней мере, три области успешного применения метода ПЦР в диагностике лейкоза: выявление носителей провирусной ДНК среди РИД- и ИфА-от-рицательных животных, исследование вновь завозимых в хозяйство животных и выявление зараженных телят в раннем возрасте.
В лаборатории биотехнологии СКНИИЖ с использованием метода ПЦР исследовано 1013 образцов крови на наличие провирусной ДНК ВЛКРС. В таблице приведены данные по инфицированности животных различных хозяйств ВЛКРС.
Анализируя полученные результаты, хоте-лось бы отметить следующее. Животные лишь одного из хозяйств (СЗАО СКВО) оказались полностью свободны от носительства прови-русной ДНК ЛКРС.
Телки голштинской черно-пестрой породы в это хозяйство были завезены из Голландии и не имели контактов с местными животны-ми. Среди других импортных животных (ОАО «Племзавод «Кубань» п = 354, завезены из Венгрии) методом РИД не были выявлены положительно реагирующие, а с помощью ПЦР удалось обнаружить 1 носителя провирусной ДНК ЛКРС. Более того, провирусную ДНК выявили и в пробе крови теленка, полученного от ПЦР-позитивного животного. Носители провируса были удалены из стада.
В хозяйстве ООО «Животноводческий комплекс «Ольгинский» из 97 проанализиро-ванных образцов 67 были получены от РИД-отрицательных животных. 15 из них оказались ПЦР-положительными.
Анализируя данные по носительству про-вируса, установили, что процент инфицированных телят к 3-4 месяцам (на основании ПЦР-исследований) практически соответствует проценту РИД-позитивных животных того же хозяйства, но в более позднем возрасте (к 3 годам). Это, вероятнее всего, свидетельствует о том, что заражение животных происходит в ранние сроки жизни (трансплацентарно и до 3 месяцев), а первые иммунологические признаки болезни появляются у большинства животных после первой лактации.
Следовательно, если проводить разделение телочек методом ПЦР на носителей провируса и здоровых в первые 2-3 недели жизни животного, можно оздоравливать хозяйства значительно быстрее.
