А. Обработка образца

Взвесьте внимательно количество образца, эквивалентное 10 мг белка (протеина), и поместите его в 100 мл колбу с круглым дном. Добавьте 10 мг 6 н. хлористоводородной ки¬слоты и промывайте в течение 24 часов под водяным охлаж¬дением в масляно-силиконовой ванне при t=110+1°C.

Отсоедините колбу для охлаждения. Выпаривайте содер¬жимое до сухого состояния при t=45°C. Добавьте 10 мл воды и повторите выпаривание. Продолжайте этот процесс 2-3 раза до тех пор, пока не избавитесь от присутствия хлори¬стоводородной кислоты. Растворите оставшийся осадок в растворе 0,02 н. хлористоводородной кислоты или в буфер¬ном растворе 0,2 н. натриево-лимонной кислоты (рН 2,2). Отфильтруйте этот раствор через пленочный фильтр,

Б. Хроматография и выделени аминокислот

Хроматографические анализы проводятся на автоматиче¬ском аминокислотном анализаторе.

16

1. Элюентный раствор

(1) Буфер А: растворите следующие количества солей в

воде; 7,14 г двойного гидрата натриево-лимонной кислоты,

7,07 г поваренной соли, 21,02 г моногидрата лимонной кисло¬

ты, 80,0 мл этилового спирта, 0,1 мл каприловой кислоты.

Добавьте воды до общего количества раствора 1 л.

(2) Буфер Б: растворите следующие количества солей в

воде: 26,67 г двойного гидрата натриево-лимонной кислоты,

54,33 г поваренной соли, 6,1 г моногидрата лимонной кисло¬

ты, 0 1  мл каприловой кислоты. Добавьте воды до общего

количества раствора 1 л.

(3) Раствор гидрата окиси натрия: растворите 8,0 г

гидрата окиси натрия и 0,1 мл каприловой кислоты в воде.

Добавьте воды до общего объема раствора 1 л.

2. Цветной реагент нингидрина:

а) растворите 164 г безводного ацетата натрия и 50 мл

кристаллизованной уксусной кислоты в воде так, чтобы об¬

щее количество раствора составило 500 мл;

б) в процессе смешивания через раствор должны посто¬

янно пропускаться пузырьки азота;

в) добавьте 1500 мл метилцеллюлозы, 40 г нингидрина и 3,4

мл раствора хлорида титана в указанный выше раствор;

г) в процессе смешивания через раствор должен постоян¬

но пропускаться азот;

д) отфильтруйте раствор при помощи пленочного фильтра;

17

е) продолжайте пропускать поток азота через смешанный

реагент для избежания контакта с воздухом до тех пор, пока

этот раствор не будет помещен на хранение в резервуар;

ж) поместите раствор в резервуар на хранение.

3. Аппаратура

(1)   HPLC   (высококачественная   жидкостная   хроматогра¬фия); автоматический аминокислотный анализатор.

(2) Колонки:

а) колонка фильтрации аммиака: хитачи гель NO.2650L

4ммх 120мм:

б) сепараторная     колонка:     хитачи     гель     NO.2619F

4ммх 150мм;

в) температурный режим в сепараторной колонке: 58-60°С.

(3) Индикатор

U. V. (W лампа), 440 NM, 0, 5 AUFS.

(4) Условия проведения реакции: тефлоновый трубчатый

змеевик 13,33ммх5м; температура - 110±1°С;  в масляно-

силиконовой ванне.

(5) Программа:

а) давление (в кг/см): максимум - 200; минимум - 0;

б) расход жидкости 0,4 мл/мин;

в) элюентный раствор

Время, Элюентный эаствор, %

в мин, Буфер А Буфер Б Раствор гидрата окиси натрия

0,0 100 0 0

10,0 100 0 0

45,0 0 100 0

56,0 0 100 0

56,1 0 0 100

63,0 0 0 100

63,1 100 0 0

100,0 100 0 0

4. Стандарты

Стандартный раствор приготавливается в рН 2,20 модель-

t ном буфере и должен содержать 0,04 U MOL мл пролина.

5. Расчеты (калькуляция)

Замерьте записанные интегратором пиковые показатели и определите количество аминокислоты в образце методом сравнения с показателями на его поверхности со стандарт¬ными.