ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНЫХ КУЛЬТУР ЛАКТОБАКТЕРИЙ

И.В. ТИХОНОВ, Ю.С. ОВСЯННИКОВ, В.Г. КОМОСКО, С.А. ШВЕЦОВ, В.Е. РОМАНОВ
ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

В последние годы в Российской Федерации наблюдается резкое ухудшение эпидемической и эпизоотической ситуации. Отмечено повышение удельного веса дисбактериозов, причиной которых являются ухудшение экологической обстановки, неконтролируемое использование в ветеринарии антибиотиков и различных химиопрепаратов, гормонов и т.п., а также стрессовые факторы и условия, снижение качества питьевой воды и кормов.

Считается бесспорным, что дисбактериозы у сельскохозяйственных животных и птиц приобретают широкое распространение, так как при отсутствии своевременной коррекции нарушений нормомикрофлоры весьма высока вероятность развития у них тяжелых, рецидивирующих инфекционных заболеваний, иммунодефицитов, различных аллергопатий, анемий, гастроэнтерологических и других болезней, включая отставание в привесах, снижение эффективности производства.

В значительной степени нелеченые дисбактериозы опасны как для молодняка, так и репропродуктивного поголовья сельскохозяйственных животных и птиц. Рост инфекционной заболеваемости бактериальной, вирусной и другой этиологии во многом предопределен снижением уровня неспецифической резистентное™ организма животных и птиц из-за выраженных дисбиотических нарушений.

В связи с вышеизложенным профилактика и лечение инфекционных заболеваний и дисбактериозов сельскохозяйственных животных и птиц в настоящее время и на ближайшую перспективу являются приоритетными задачами ветеринарии. Их решение возможно при условии реализации комплекса соответствующих противоэпизоотических мероприятий, включая разработку, серийное производство и внедрение в практику новых лечебно-профилактических средств для предупреждения и терапии инфекционных заболеваний и дисбактериозов, отвечающих современному мировому уровню. При этом немаловажное значение для обеспечения действенности системы этих мероприятий имеет адекватность и единая методология использования соответствующих лечебно-профилактических препаратов. Таковые в свою очередь обуславливают необходимость подготовки, утверждения и доведения до широкого круга ветеринарных специалистов информационно-методических и справочных документов по вышеназванным проблемам.

При этом очевидна необходимость углубления работ по проблеме пробиотиков в аспекте поиска новых штаммов микроорганизмов с пробиотическим действием, совершенствования имеющихся и создания новых препаратов данного вида для повышения их эффективности.

Ввиду незначительного числа публикаций об эубиотическом действии лактобактерий в отечественной литературе актуальными являются исследования механизмов их антагонистического действия и условий сохранения, поддержания и усиления полезных свойств. Полученные результаты могут служить основой для разработки современных высокоэффективных пробиотиков на основе лактобактерий для ветеринарных целей.

В процессе проведения научно-исследовательских работ в этом направлении требуется выявить штаммы лактобактерий, проявляющих максимальную способность подавлять развитие энтеро-, пиогенных и колипатогенных микроорганизмов, исследовать механизм их антагонистического действия, условия поддержания и сохранения штаммов. Определить оптимальное соотношение отобранных штаммов в препарате, разработать способ приготовления препарата, обеспечивающий ему необходимые эксплуатационные характеристики и провести его испытания на сельскохозяйственных животных и птице.

Анализ данных литературы в области выбора микро-организмов и разработки технологии получения препаратов с пробиотическим действием и их использования позволил определить основные направления исследований:

-   поиск и оценка биологических свойств новых штаммов микроорганизмов с пробиотическим действием;

-   разработка на их основе ассоциированных культур;

-   разработка методов приготовления и поддержания эталонных и посевных рабочих культур штаммов микроорганизмов с пробиотическим действием;

-   разработка жидкой питательной среды, обеспечивающей интенсивное накопление биомассы лактобактерий в процессе периодического динамического гомогенного глубинного культивирования;

-   изучение  закономерности   роста  бактериальной популяции в аэробных и анаэробных условиях;

-   выбор оптимальных параметров глубинного культивирования микроорганизмов с пробиотическим действием с целью сохранения их биологически полезных свойств;

-   разработка готовой формы препарата с пробиотическим действием на основе штаммов лактобактерий, возможно, в комбинации с другими бактериями;

-   оценка воспроизводимости технологии приготовления препарата с пробиотическим действием;

-   изучение специфической безопасности и токсичности препарата на лабораторных животных;

-   проверка эффективности использования разработанной ассоциации пробиотика в практическом животноводстве и птицеводстве.

Материалы и методы исследования. В работе использовали штаммы микроорганизмов рода лактобацилл (Lactobacillus plantarum №3 и Lactobacillus buchneri №4) из коллекции культур НИИ Микробиологии МО РФ.

Для выращивания штаммов лактобактерий с целью оценки их биологических свойств готовили питательные среды на основе сред МРС-1 и МРС-4 в соответствии с методикой, изложенной в ФС на "Лактобактерин сухой".

Посевную рабочую культуру лактобактерий получали путём ряда пересевов сухой эталонной культуры на стандартные питательные среды МРС. На последней стадии была приготовлена агаровая культура со смывом её криопротектором с последующим замораживанием и хранением при температуре минус 20°С.

Культивирование лактобактерий осуществляли в 20-литровых бутылях с жидкой питательной средой МРС-1. Культуры Lplantarum и L.buchneri в бутылях выращивали методом глубинного периодического культивирования с перемешиванием без аэрации при температуре (37±1)°С в течение 48 и 72 часов.

Контроль сред осуществляли по физико-химическим и биологическим показателям.

Результаты исследования. Для приготовления посевных рабочих культур штаммов лактобактерий использовали свежепересеянную эталонную культуру штаммов лактобактерий на питательных средах МРС. Для этого бактериальной петлёй отбирали изолированные колонии с плотной питательной среды МРС, суспендировали в физиологическом растворе и пересевали в жидкую питательную среду МРС во флаконе. Посевы инкубировали при температуре 36...38°С в течение 48 часов. Бульонные культуры затем пересевали на матрац со скошенной плотной питательной средой МРС из расчёта 5,0 мл культуры на один матрац. Посевы в матрацах инкубировали при температуре 36...38°С в течение 48 часов для штамма L.plantarum 3 и 72 часов для штамма L.buchneri 4. По истечении срока инкубации агаровую культуру использовали для приготовления посевной рабочей культуры. Для этого сформировавшийся на ППС микробный газон смывали 10,0 мл 1,5%-ного раствора полиглюкина.

Учитывая высокую биохимическую активность штаммов лактобактерий, традиционная пропись защитной среды при замораживании (сахарозо-желатиновая) не могла быть нами использована. В связи с этим был применён нейтральный и достаточно изученный криопротектор полиглюкин.

Приготовленную микробную суспензию с полиглюкином разливали по 5 мл в пробирки и помещали на хранение при температуре минус 20°С.

Результаты оценки выживаемости штаммов лактобактерий в составе свежеприготовленных и хранившихся посевных рабочих культур представлены в табл. 1.

Анализ данных, представленных в табл. 1, свидетельствуют о том, что микробные культуры штаммов лактобактерий в составе выбранного нами криопротектора обладают достаточно высокой устойчивостью к замораживанию и хранению при температуре минус 20°С. Наибольшее количество живых микробов нами зафиксировано к б месяцам хранения культур в замороженном состоянии. В дальнейшей работе нами использовались посевные рабочие культуры, хранившиеся при температуре минус 20°С не более б месяцев.

Таблица 1

Характеристики свежеприготовленных и хранившихся при температуре минус 20°С посевных рабочих культур штаммов лактобактерий (X±Ig5, n=5)

Исходя из особенностей и способа применения препарата пробиотического действия в ветеринарии, необходима технология получения готовой формы препарата, которая позволяла бы сохранять не менее одного года высокую антагонистическую активность и кислотообразующую способность, быть безвредной, удобной при использовании. Результаты испытания штаммов лактобактерий в промышленном птицеводстве, полученные в ходе выполнения исследований, позволили установить, что минимальная концентрация живых клеток лактобактерий в готовой форме препарата должна составлять не менее ЗхЮ9 в мл.

Для получения лечебно-профилактического препарата с заданной концентрацией технология должна включать ряд последовательных стадий для накопления достаточной биомассы лактобактерий. Технологический процесс накопления биомассы из посевных рабочих культур в наших исследованиях состоял из следующих стадий:

-   получение посевных культур I пересева;

-   получение посевных культур II пересева.

Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что микробы штаммов лактобактерий в составе стабилизированных замороженных культур обладают достаточно высокой выживаемостью и могут обеспечить необходимую концентрацию для получения посевных культур I пересева.

Для получения культур I пересева посевные рабочие культуры лактобактерий после размораживания из пробирок пересевали на скошенную плотную питательную среду МРС-4 в матрацах. Посевы инкубировали при температуре (37+1)°С в течение 48 ч. Концентрацию лактобактерий в посевной культуре определяли путём подсчёта клеток в камере Горяева.

Результаты определения концентрации лактобактерий в посевных культурах I пересева представлены в табл. 2.

Таблица 2
Концентрация клеток в посевных культурах лактобактерий I пересева в матрацах со скошенной агаризованной средой

Результаты исследования, отражённые в табл. 2, показали, что одна пробирка, содержащая 5 мл посевной рабочей культуры, при посеве в матрац с плотной питательной средой МРС-4 (культура I пересева) даёт выход биомассы лактобактерий не ниже 30 млрд кл. в мл.

Для получения культур II пересева агаровые культуры лактобактерий из матрацев пересевали в 20-литровые бутыли с жидкой питательной средой МРС-1. Выращивание посевных культур L.plantarum и L.buchneri в бутылях осуществляли методом глубинного периодического культивирования с перемешиванием без аэрации при температуре (37±1)°С в течение 48-72 часов соответственно.

Посевная доза для засева бутылей составляла около 0,4109 микр. кл. в мл. Инокулят вносили в количестве 10% от объёма жидкой питательной среды. Накопление биомассы лактобактерий в культуре определяли подсчётом клеток в камере Горяева.

Результаты определения концентрации лактобактерий в посевных культурах II пересева представлены в табл. 3.

Таблица 3
Концентрация клеток в посевных культурах лактобактерий II пересева в 20-литровых бутылях

Исследования показали, что 10 матрацев агаровой культуры с выходом биомассы 30 млрд кл. в мл позволяют обеспечить посевную дозу для одной двадцатилитровой бутыли с жидкой средой МРС-1 (культуры II пересева) с выходом биомассы штаммов лактобактерий не ниже 30 млрд кл. в мл.

журнал "Ветеринарная медицина" 1-2 2009