Учитывая долгий период сексуальной рецептивности у сук, включающий овуляцию и период созревания гамет, фертильным следует считать интервал между 4 и 7 днем после пика концентрации ЛГ. Однако не исключено, что ближе к окончанию фертильного периода способность к оплодотворению снижается, тогда как некоторые ситуации требуют особенно надежного вычисления (например, искусственное осеменение замороженной спермой). Для определения фертильного периода и оптимальных сроков вязки применяют различные методы, к которым относятся вагинальная цитология, вагинальная эндоскопия и анализ концентрации гормонов в сыворотке крови.

 Вагинальная цитология

Повышение концентрации эстрадиола в период проэструса стимулирует деление клеток в ба-зальных слоях вагинального эпителия, но затем концентрация эстрадиола, а соответственно и эндокринная поддержка образования нового, многослойного эпителия снижается, поэтому в образце обнаруживается больше мертвых орого-вевших клеток. По мере развития проэструса снижается количество эпителиальных клеток, содержащих ядро. С начала до середины проэструса в вагинальных мазках обнаруживают по-вышенное содержание эритроцитов. Пик ороговения совпадает с началом повышения концентрации прогестерона; однако в начале эструса исследование не обнаруживает характерных особенностей, которые могли бы указывать на начало фертильного периода. Как правило, такой период наступает несколькими днями позже (табл. 1.1). Тем не менее вагинальная цитология остается популярным методом определения репродуктивного статуса суки из-за своей дешевизны, простоты и доступности. Для получения образца используют ватный тампон, предпочтительно небольшой, который вводят во влагалище и осторожно берут мазок. Полученные клетки помещают под микроскоп, а затем окрашивают контрастным (трихромом) или неконтрастным (например, препаратом Diff-Quik) веществом. При таком окрашивании мертвые кератинизированные клетки становятся оранжевыми, тогда как активные ядерные клетки, а также базальные и парабазальные эпителиальные клетки приобретают различные оттенки от голубого до зеленого.

Ближе к окончанию эструса вагинальные выделения претерпевают характерные изменения (снова выявляются эпителиальные клетки, содержащие ядро, и появляется большое количество лейкоцитов). Такая картина обычно наблю-дается через 7—9 дней после пика ЛГ и известна как «вагинальный мазок метэструса». Изменению характера выделений предшествует переходный период, характеризующийся возрастающим количеством активных клеток и указываю-щий на окончание фертильного периода и эструса (табл. 1.1).

Вагинальная цитология весьма информативна в плане определения фазы эстрального цикла, однако значительные расхождения во времени появления основных признаков эструса по отношению к пику фертильности ограничивает применение указанной методики.

Вагинальная эндоскопия

Прекращение секреции эстрадиола фолликулами и переход их к секреции прогестерона при-водят к снижению как отечности, так и васкуля-ризации слизистых оболочек, что сопровождается выраженным изменением характера вагинальных выделений, выявляемым с помощью вагинальной эндоскопии. На стадии проэструса слизистая оболочка становится более выпуклой и отечной, затем наблюдается ее уменьшение; по мере приближения овуляторного пика слизистая сжимается и бледнеет, в некоторых случаях становясь практически белой (фиг. 1.1). Перечисленные изменения свидетельствуют о приближении стадии, характеризующейся постепенным повышением концентрации прогестерона перед овуляцией и последующим наступлением фертильного периода. Эти изменения легко узнать, имея даже небольшую практику (фиг. 1.3), кроме того, они настолько воспроизводимы, что по набору признаков их можно оценивать полуколичественно. Вагинальная эн-доскопия весьма полезна в определении оптимальных сроков вязки. По окончании фертильного периода, т.е. в начале метэструса — слизистая оболочка влагалища бледнеет и истончается, складки становятся закругленными — и что, вероятно, является наиболее характерным признаком, — слизистая в переднем отделе влагалища выглядит раздраженной и при прикосновении быстро сжимается, образуя розетку.

Измерение концентрации гормонов

Данные о концентрации прогестерона в сыворотке крови могут служить ориентиром для определения фертильного периода у сук. Механизмы и динамика изменения концентрации прогестерона описаны в предыдущем разделе (фиг. 1.2).

В конце анэструса концентрация прогестерона в сыворотке крови находится на базальном уровне (и практически не определяется), к окончанию проэструса она повышается до низкой, но поддающейся определению отметки (около 3 нмоль/л или 1 нг/мл). И продолжает повышаться, достигая уровня 3—6 нмоль/л ( 1—2 нг/мл) к моменту овуляторного пика ЛГ; 2 дня спустя (в день овуляции) показатели достигают 6—12 нмоль/л (2—4 нг/мл), а к 4 дню (т.е. к началу фертильного периода) — 18—30 нмоль/л (6—10 нг/мл) (фиг. 1.1). Концентрацию прогестерона определяют в плазме крови, поскольку анализ других жидкостей (слюны и мочи) в настоящее время не дает точных результатов. Исследование проводят после появления первых признаков проэструса и повторяют по меньшей мере каждые 2—3 дня до окончания проэструса или начала поведенческого эструса. Такая методика позволяет выявлять стремительное нарастание концентрации прогестерона перед овуляцией и соответственно рассчитать дату возможной вязки. В случаях очень короткого проэструса исследование начинают раньше.

В зависимости от метода исследования (радиоиммунный или иммуноферментный) возможны некоторые расхождения в показателях концентрации прогестерона; при этом следует

Фиг. 1.3. Эндоскопическое исследование слизистой влагалища. Динамика изменений на протяжении цикла: (а) про-этрус - розовая окраска и отечность; (Ь) начало эструса - слизистая бледнеет, отек начинает уменьшаться (обычно перед пиком ЛГ); (с) середина эструса - слизистая бледная, уменьшение отека (сморщивание) явно выражено, что соответствует середине фертильного периода; (а1) начало метэструса - видны закругленные складки, при прикосновении слизистая смыкается, образуя розетку (е) (см. Приложение)

учитывать, что иммуноферментный метод дает завышенные, но в остальном надежные результаты. Большая часть опубликованных данных (включая данные, приведенные в настоящей главе) получены с помощью радиоиммунного метода. Готовые иммуноферментные тест-системы, предназначенные для определения концентрации прогестерона в плазме крови на различных, стадиях астрального цикла, дают результаты, почти вдвое превосходящие данные радиоимунного анализа (РИА), но в той же степени отражающие характерные циклические изменения. С помощью готовых наборов нельзя получить абсолютные показатели концентрации прогестерона, но можно проследить относительные изменения его концентрации от начала проэструса и до конца цикла.

Прогестерон является единственным гормоном, концентрацию которого используют как ориентир при вычислении фертильного периода. Хотя ЛГ и эстрадиол в этом отношении даже более информативны, их определение не прак-тикуется.

Другие аспекты определения фертильного периода

Последние рентгенографические исследования влагалища с применением контрастного вещества выявили устойчивую связь между концентрациями эстрадиола и прогестерона в крови и раскрытием шейки матки. Результаты этих исследований имеют решающее значение для определения фертильного периода у собак, поскольку шейка матки остается закрытой (непроницаемой для контрастного вещества и, вероятно, сперматозоидов) до тех пор, пока не произойдет снижение концентрации эстрадиола и не вырастет соотношение прогестерон/эстрадиол во время преовуляторного периода. После пика Л Г шейка матки остается открытой в течение приблизительно 6 дней (т.е. она закрывается примерно за 2 дня до начала цитологического метэструса), и в этот период концентрация прогестерона остается высокой, а эстрадиол практически не определяется. Приведенные данные свидетельствуют о том, что сперматозоиды имеют доступ в шейку матки только в ограниченное время эс-труса вопреки общепринятому мнению, согласно которому вязку можно проводить как до, так и после раскрытия шейки матки. Изменения состояния шейки матки объясняются утолщением слизистой оболочки под воздействием эстрогена на стадии проэструса, что приводит к закры-тию шейки матки. Последующее раскрытие шейки матки сопровождается снижением отечности слизистой оболочки и обусловлено увеличением соотношения прогестерон/эстрадиол.

 Интересно, что период, когда шейка матки раскрыта, соответствует оптимальным срокам вязки, рассчитанным на основании результатов эндоскопического исследования слизистой влагалища. Данные рентгенографических исследований с применением контрастного вещества удобны для интерпретации, однако не объясняют, каким образом на стадии проэструса кровь и маточный секрет проникают через отечную шейку матки. Вероятно, сказывается влияние других активаторов, например, эстрогенов, способных расслаблять гладкую мускулатуру, а также простагландинов, содержащихся в сперме.

Необходимость повышения концентрации прогестерона для наступления эструса и индукции овуляторного пика ЛГ указывает на то, что устойчивые проявления течки наблюдаются лишь непосредственно перед началом фертильного периода. Хотя начало течки по отношению к пику ЛГ — индивидуальная характеристика особи (табл. 1.1), указанные проявления могут служить ориентиром для вычисления фертильного периода.