РазместитьСтегний Б. Т., Мартыненко А. А.
Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины»
Национальной академии аграрных наук Украины
Государственное учреждение «Институт сельского хозяйства степной зоны Украины»
Национальной академии аграрных наук Украины Адрес: 49600, Украина, г. Днепропетровск, ул. Дзержинского, 14
Введение
На сегодняшний день в Украине одной из развивающихся отраслей птицеводства является голубеводство. Только в спортивную федерацию высоколетного и гонного голубеводства Украины входит около 38 за-регистрированных клубов, которые специализируются на разведении ценных пород, организации выставок и проведении спор-тивных соревнований голубей на короткие и дальние дистанции. В отличие от стран Европейского союза, мероприятия по профилактике инфекционных заболеваний голубей в Украине ограничены и осуществляются только усилиями заводчиков. Проблема ньюкаслской болезни (ND) у голубей и голубеобразных стала очевидной после возникновения третьей панзоотии в конце 1970 годов на Среднем Востоке [9]. Заболевание имело сходство с нейротропной формой у кур, но без респираторных признаков. К 1981 году оно достигло Европы, после чего быстро распространилось на другие континенты. В Великобритании, например, среди невакцинированных кур в 1984 году произошло двадцать вспышек этого заболевания. Причиной явился корм, зараженный инфицированными голубями. Свидетельством распространения в Украине вируса ND среди синантропной птицы является сообщение Максимчука С. И. о выделении трех изолятов от голубей в Киевской и Донецкой областях в 2001-2005 годах. Вышеизложенное подтверждает актуальность изучения проблемы парамиксовирусной инфекции голубей.
Материалы и методы
Выделение вируса проводили на 9-дневных куриных эмбрионах. Для этого 10 % суспензию исследуемого материала вводили в аллантоисную полость в объеме 0,2 см3. Зараженные и контрольные эмбрионы ин-кубировали при 37 °С в течение 168 часов. При наличии гемагглютинации эритроци-тов или гибели эмбрионов проводили иден-тификацию выделенного вируса в реакции торможения гемагглютинации (HI tests) с использованием специфических сывороток к парамисксовирусам (PMV) 1, 2, 3-го сероти-пов и вирусу гриппа подтипов Н5, Н7.
Определение патотипа вируса проводили по оценке среднего времени гибели (MDT) 9-дневных куриных эмбрионов, вызванной минимальной летальной дозой (DL ).
Для проведения исследования готовили 10-кратные разведения исследуемого вируса (от Ю-1 до Ю-10), пять из них (Ю-1, 107, 108, 10~9, 10~10) использовали для заражения куриных эмбрионов в аллантоисную полость в объеме 0,1 см3. Каждым разведением инокулировали 10 эмбрионов: 5 эмбрионов заражали в 8 часов и 5 эмбрионов - в 16 часов. Овоскопию проводили 2 раза в день с регистрацией времени гибели каждого эмбриона. Минимальной летальной дозой считали самое большое разведение вируса, вызывающее гибель всех инокулированных эмбрионов. MDT находили путем деления суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванное минимальной летальной дозой, на количество эмбрионов. По среднему времени гибели эмбрионов разделяли вирусы ND на велогенные штаммы (MDT до 60 часов), мезогенные -от 60 до 90 часов, лентогенные - больше 100 часов.
Изоляцию суммарных нуклеиновых кислот проводили в лаборатории молекулярной эпизоотологии и диагностики ННЦ «ИЭКВМ» с помощью наборов для экстракции РНК «Рибосорб», а обратную транскрипцию - с помощью набора «Реверста Л» производства фирмы АплиСенс, Москва, Российская Федерация.
Секвенирование проводили с использованием праймеров NDV4331F/5009R. Химический сиквенс был проведен с использованием коммерческих наборов AbiPrism Terminator Kit (Applied Biosystems). Электрофоретический анализ продуктов реакции был осуществлен на ДНК-анализаторе ABI-3000 (AbiPrism) на базе Южно-Восточной опытной лаборатории по изучению болезней птиц (Атенс, США). Корректировку сиквенса проводили с помощью пакета программ DNAStar, LaserGene.
Построение множественного выравнивания с гомологичным участком гена F, опубликованными в базах GenBank, осуществляли с помощью on-line программы Clustal W. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей был проведен по методу Neighbor Joining с использованием компьютерной программы Mega 4.
Результаты исследований
Серологический мониторинг синантроп-ной птицы проводили на протяжении 2005-2010 гг. с целью изучения циркуляции вируса ND в природе. Было исследовано 7 видов синантропной птицы (голуби, сороки, галки, вороны, воробьи, сойки, ласточки) из 6 городов и 22 районов Днепропетровской области. Антитела к вирусу ND были выявлены в сыворотке крови синантропной птицы одного города и 7 районов после исследований 1241 пробы. Так, у голубей антитела были в пределах от 1 : 2 (1 log2) до 1 : 1024 (10 log2). Эти данные важны, поскольку голуби тесно контактируют с птицей, которая обитает на территории кормоцехов птицехозяйств. У сорок и ворон было выявлено серопозитивность в титрах 1 : 8 (3 log2), что может быть связано с циркуляцией эпизоотических и вакцинних штаммов в природе.
Учитывая результаты серологического мониторинга, нами были проведены вирусологические исследования патологического материала от голубей Днепропетровской области. В результате работы было изолированно 3 парамиксовируса, аутоэнтичность которых установлена молекулярно-диагностическими исследованиями с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) в ННЦ «ИЭКВМ». Анализ нуклеотидных последовательностей позволил дифференцировать антигенноподобные вирусы и получить важные эпизоотические данные о происхождении того или иного изолята. В ходе исследований было установлено, что топография филогенетических связей изолята Pigeon/Dnepropetrovsk-07/2007 соответствовала второму генотипу, что демонстрирует не-контролированное распространение вакцинных штаммов в невакцинированных популяциях синантропной птицы. Изолят Pigeon/ Ukraine/Dnepropetrovsk/1 -18-11 принадлежал восьмому генотипу и имел выраженное родство с российским штаммом Pigeon/Rus/ Kemerovo/592-1/05 (98 %).
Учитывая, что основной метод культивирования парамиксовирусов -куриные эмбрионы, при определении степени патогенности полевых изолятов использовали указанную чувствительную биологическую систему. В ходе исследований установлено, что MDT куриных эмбрионов составляло больше 100 часов при использовании минимальной летальной дозы после разведения исходного вируса от первого пассажа. Полученные данные могут свидетельствовать о длительном развитии адаптационной вирулентности голубиных изолятов вируса ND к куриным эмбрионам. Свидетельством адаптационной вирулентности парамиксовирусов PMV-1 может служить выделение изолятов от кур, фазанов, бакланов [6].
Обсуждение результатов
Анализ эпизоотической ситуации по ND в историческом аспекте Украины свидетельствует о высокой степени риска возникновения вспышек заболевания, что подтверждают данные МЭБ и сообщения некоторых ученых [4]. При серологическом мониторинге семи видов синантропной птицы Днепропетровской области позитивные титры были выявлены у трех видов. Так, у голубей колебания титров к вирусу ND составляли 1-10 log2, а у сорок и ворон - 3 log2. Наличие антител к вирусу ньюкаслской болезни у синантропной птицы может быть связано с контактом этих птиц с вакцинными штаммами во время вакцинации сельскохозяйственной птицы методами выпойки или аэрозольно, о чем свидетельствуют сообщения отечественных и зарубежных ученых [7, 5]. Также необходимо учитывать возможный контакт с эпизоотическими штаммами, циркулирующими в природе, или контакт с птицей, которая питается на территории птицеводческих бригад и гнездится в посадках в непосредственной близости от птичников [3]. Таким образом, синантропная птица, которая активно осваивает ареалы при птицекомплексах, является первым звеном эпизоотической цепи в птицеводстве, о вероятности чего свидетельствуют сообщения некоторых авторов [2]. Молекулярные основы патогенности вируса ND свидетельствуют, что вирулентность коррелирует с первичной структурой сайта нарезания FQ. M. Collins и соавторы установили, что для высоковирулентных штаммов вируса ND характерна последовательность 112R/K-R-Q-K/R-R-F117, тогда как у апатогенных вирусов структура сайта разрезания Fo представляет собой последовательность 112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117 [8]. Наличие у высоковирулентных штаммов двух пар основных аминокислот (112-113 и 115-116) и фенилаланина (117) обозначает, что необходимый для активации вируса посттрансляционный процессинг FQ может осуществляться протеазами, присутствую-щими во многих тканях и органах птицы. Для разрезания белка Fo у вирусов с низкой вирулентностью необходимы трипсиноподобные протеазы, которые узнают одинокий аргинин (R) в сайте разрезания. Репликация такого вируса в отличие от высоковирулентных штаммов вируса ND ограничена респираторным и пищеварительным трактами, где присутствуют эти ферменты. Таким образом, первичная структура сайта разрезания белка FQ обуславливает тропизм вирусов к определенным органам и тканям и, соответственно, степень вирулентности, связанную с генерализацией вируса [1]. В ходе работы у изолята Pigeon/Ukraine/Dnepropetrovsk/1 -18-11 выявили аминокислотную последовательность сайта разрезания F0 белка, типичную для велогенных вирусов, хотя MDT эмбрионов составляло 115 часов, что характерно для лентогенных вирусов. Следовательно, результаты при проведении обычных тестов на изолятах от голубей не соответствуют вирулентности вируса по отношению к курам. Хотя тесты на патогенность являются очень ценными для установления разницы между вакцинными, эпизоотическими вирусами при вспышках заболевания, необходимо учитывать, что им присущи некоторые сложно-сти в интерпретации результатов.
Заключение
1. Днепропетровская область и г. Днепропетровск являются зоной повышенного риска возникновения и распространения парамиксовирусной инфекции голубей. К факторам наибольшего риска относят высокую плотность объектов птицеводства и голубеводства, отсутствие системной иммунизации против ньюкаслской болезни на голубятнях, несовершенство нормативной базы, регламентирующей профилактические мероприятия на приусадебных и голубеводческих объектах.
2. При исследовании сыворотки кровиголубей центрального региона Украины в HI tests, установлена этиологическая роль возбудителя парамиксовирусной инфекции 1 типа. Титры антител при этом колебались от 1 до 10 log2.
3. В ходе вирусологических исследований материала от павших голубей выделено три PMV-1 и установлены особенности определения их патотипа.
Список литературы
1. Манин, Т. Б. Характеристика полевого изолята вируса ньюкаслской болезни, выделенного во время вспышки на птицефабрике в Ленинградской области в 2000 г. / Т. Б. Манин [и др.] // Вопросы вирусологии. -2002.-№6. -С. 41-43.
2. Пименов, Н. В. Вакцинопрофилактика сальмонеллеза голубей и декоративных птиц / Н. В. Пименов // Ветеринария. - 2012. - № 8. - C. 20-22.
3. Герилович, А. П. Вивчення ешзоотичного стану з хвороби Марека та и профшактики в Украйи / А. П. Герилович // Ветеринарна медицина: м1жвщ. темах наук. зб. - X., 2004. - Вип. 83. - С. 28-31.
4. Зандарян, С. Ю. Определение индекса интрацеребральной патогенности изолятов вируса Ньюкаслской болезни на переперятах / С. Ю. Зандарян // Ветеринарна медицина: м1жвщ. темат. наук. зб. — X., 2005. - Вип. 85, т. I. - С. 457-462.
5. Землянская, О. А. Серологический контроль некоторых вирусных инфекций сельскохозяйственнойи синантропной птицы / О. А. Землянская // Ветеринарна медицина : м1жвщ. темат. наук. зб. - X., 2004. — Вип. 83. - С. 94-97.
6. Максимчук, С. Г. Визначення в1рулентност11золяпв Bipycy хвороби Ньюкасла, видшених в 2001—2005 pp. вщ голуб1в [Електронний ресурс] / С. Г. Максимчук // Ветеринарна бютехнолопя. Бюлетень 2008. - № 13. - Режим доступу : http://www.nbuv.gov.ua/portal/Chem Biol/VBtl/texts/2008-13/index.html - 24.04.2012 p. - Загол. з екрану.
7. Музика, Д. В. Ешзоотолопчний мониторинг синантропних nraxiB Укра'ши щодо основних в1русних шфекцш / Д. В. Музика, Б. Т. Стегнш // Ветеринар на медицина : м1жвщ. темат. наук. зб. — X., 2005. - Вип. 85, т. I. - С. 798-804.
8. Collins, M. S. Evalution of the molecular basis ofpathogenicity of the variant Newcastle disease viruses termed "pigeon PMV-1 viruses"/M. S. Collins, I. Strong, D. J. Alexander // Ibid. - 1994. -Vol. 134. - P. 403-441.
9. Kaleta, E. F. The first isolation of the PMV-1 virus responsible for the current panzootic in pigeons? / нE. F. Kaleta, D. J. Alexander, P. H. Russell //Avian Pathol. - 1985.-№14. -P. 553-557.
