Г.Д. СИДЕЛЬНИКОВ, Д.В. КОЛБАСОВ, А.Ю. ЧИЧИКИН, И.Ю. ВОЛКОВА, А.В. РЖАВИН
ВНИИВВиМ

Артрит-энцефалит коз (АЭК) - медленно протекающее вирусное заболевание, характеризующееся развитием демиелинизирующего энцефалита, прогрессирующего артрита, интерстициальной пневмонии, реже - маститов, оканчивающееся летально [3,4].

Болезнь распространена повсеместно, но чаще встречается в районах с интенсивным козоводством. Симптомокомплекс поражения трех систем органов (центральной нервной системы, суставов, легких) у коз описан во многих странах [2, 9], в том числе и в России [1]. При этом только у 1 -2 % инфицированных животных поражается центральная нервная система (в основном молодняка) и до 30 - 40 % (впоследствии) - суставы.

Существующие в настоящее время программы искоренения артрита-энцефалита коз за рубежом включают комплекс взаимосвязанных звеньев [7, 8, 10]: серологическое обследование импортируемых и продаваемых в другие хозяйства внутри страны коз, выявление скрытых вирусоносителей с использованием ПЦР-анализа, а также карантинирование и оздоровление неблагополучных по инфекции хозяйств. До появления молекулярно-биологических методов диагностики артрита-энцефалита коз основным инструментом для обнаружения больных животных было серологическое обследование восприимчивого поголовья такими способами, как реакция диффузионной преципитации в агаровом геле и иммуноферментный анализ в различных модификациях [5, 6].

В программах по контролю АЭК наряду с выявлением всех серопозитивных животных особое значение имеет обнаружение вирусоносителей - наиболее опасных источников инфекции. Создание и совершенствование высокочувствительных молекулярно-генетических методов значительно облегчают осуществление программ по искоренению болезни.

Цель наших исследований - разработать и провести мероприятия по оздоровлению хозяйства от артрита-энцефалита коз с применением ПЦР- анализа как сигнального метода диагностики.

Материалы и методы. Диагностические исследования провели в одном из козоводческих хозяйств Тверской области, а лабораторные - на базе ВНИИВВиМ, используя образцы крови от клинически больных и подозреваемых в заражении животных. Во время транспортировки пробы крови стабилизировали ЭДТА (Трилон-В). Кровь брали 4 раза: первый в марте 2003 г. у подозреваемых и клинически больных животных (п=7), а также у основных производителей (п=3); второй -в мае 2005 г. у всех особей, полученных от ранее исследованных производителей (п=104); третий - в июне 2006 г. (п=25); четвертый - в январе 2007 г. (п=25).

Провирусную ДНК в образцах крови животных выявляли ПЦР-анализом.

Последний обладает наиболее высокой чувствительностью и специфичностью, кроме этого в отечественной практике отсутствуют средства серологической диагностики. При проведении ПЦР-анализа препараты нуклеиновых кислот, выделенные из крови животных, гибридизировали праймерами, комплементарными последовательностям gag-гена вируса АЭК, фланкирующими ампликоны размером 392 и 173 п.о. соответственно. Пробы ДНК амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей: 20 pmoles каждого праймера; 200 мкМ смеси dNTP; 25 mM Tris HCI, рН 8,8; 60 mM KCI; 2,5 mM MgCI2; 7,5 мМ EDTA; 0,5% Tween 20; 0,01% желатины и 2 ед. Tag-полимеразы. Режим амплификации    на  термоцикле "Touchdown" фирмы Hybaid был следующим: денатурация 94 °С - 30 с, отжиг прай-меров 55 °С - 30 с, элонгация цепи 72 °С -30 с (35 циклов), финальная элонгация 72 °С - 3 мин. Результаты амплификации учитывали с помощью электрофореза в 2,0 %-ном агарозном геле.

Результаты исследований. В 1992 г. у коз, завезенных из госплемзавода "Никоновский" Раменского района Московской области, отметили первые признаки болезни - развитие хронических артритов, чаще карпальных суставов, хромоту, маститы с последующей индурацией вымени, агалактию. Различные схемы терапии животных ожидаемого эффекта не принесли. Коз выбраковывали в начальной стадии развития парезов конечностей и кахексии. Случаев выздоровления не зафиксировали. К моменту проведения работы (весна 2003 г.) в стаде насчитывалось: 60 дойных коз зааненской породы, 23 козы в возрасте 1 год, 1 козел англонубийской породы и 3 зааненской породы.

По результатам эпизоотологического анализа и клинического обследования животных поставили предварительный диагноз - артрит-энцефалит коз, а молекулярно-генетическими исследованиями проб крови методом ПЦР-анализа подтвердили его.

При выборочном анализе образцов (п=10) в марте 2003 г. провирусную ДНК выявили в крови 2 основных производителей и 1 взрослой козы. Массовое повторное исследование в мае 2005 г. показало, что уровень инфицированности поголовья составил 8,7 % (9 положительных проб из 104 исследованных).

Установив факт циркуляции возбудителя в хозяйстве, провели комплекс мероприятий, включающий карантинные и ветеринарно-санитарные меры. Были приостановлены хозяйственно-экономические связи с партнерами (купля - продажа животных, кормов, молока и сыра), оборудованы дезбарьерами въездные пути в хозяйство и помещения. Положительно реагирующих коз с клинической формой болезни немедленно изолировали из стада с последующим их убоем на специально оборудованной площадке. Туши выбракованных животных уничтожали сжиганием. Особей, в крови которых обнаруживали провирусную ДНК ВАЭК, в последующем также убивали. Исключение составляли лишь особо ценные в племенном отношении козематки, которых выбраковывали по мере получения от них последнего приплода.

Для предотвращения передачи возбудителя козлят, полученных от положительно реагирующих на ВАЭК маток, отнимали немедленно после рождения (до момента облизывания их и первого акта сосания) и в дальнейшем им выпаивали только обеззараженное козье молозиво, а также пастеризованное коровье молоко. Молозиво обеззараживали при 56 °С в течение 60 мин. Посуду регулярно автоклавировали при 120 °С в течение 30 мин.

Животноводческие помещения и производственные цеха дезинфицировали 3%-ным горячим раствором NaOH с последующей побелкой площадей, а кормушки и инвентарь на выгульных двориках и летних кормовых площадках - 3%-ным раствором формальдегида.

В животноводческих помещениях, кормоцехе, цехе готовой продукции и складах провели дератизацию, используя препарат аратам-к.

По результатам определения вирусоно-сительства среди коз (ПЦР-анализ) мы отслеживали движение инфицированных животных внутри стада (учитывая источники его пополнения), изучали гениалогическое древо козлов-производителей, коз маточного поголовья и их потомства. На основании этих данных выявили прямую наследственную связь всех АЭК-позитивных животных.

По мере проведения селективной (результаты ПЦР-анализа) выбраковки инфицированных особей контролировали "чистоту" получаемого приплода. В январе 2007 г. из 25 проб крови молодняка от положительно реагирующих родителей только 1 была положительной. Причиной этого послужило несоблюдение методики экстренного отъема новорожденных козлят от маток в момент их рождения.

Заключение. Результаты по оздоровлению хозяйства от артрита-энцефалита коз по рекомендуемой нами схеме позволяют считать ее эффективной при условии планомерного и полномасштабного выполнения этих мероприятий. При исходном уровне инфицированности поголовья коз в 2005 г. 8,7 % к 2007 г. процент положительно реагирующих животных был сведен до минимума, с полным отсутствием инцидентности болезни.

ЛИТЕРАТУРА

1. И.Ю. Волкова и др. //Ветеринария. 2007. № 1.

2. Caprine Arthritis/Encephalitis in Bosnia and Herzegovina. //OIE. FAO. HandiSTATUS , 20.04.2005.

3. Cork L.C. et al. // J. Infec. Dis. 1974, 129.

4. Crawford T.B. et al. // Science. 1980, 207.

5. Cutlip R. С et al.// Am. J. Vet. Res. 1977, 3.

6. Houwers D. J. et al. // Vet. Microbiol. 1982, 7.

7. Krieg A. et al.// Schweiz. Arch. Tierheilkd. 1990, 132.

8. Kuhn N. // Faculty of Veterinary Medicine, University of Bern, Bern, Switzerland. 1998.

9. Misako Konishi et al. //J. Vet. Med. Sci. 2004, 66(8). 10. Peterhans E. et al. // Vet. Res. 2004, 35.

Журнал "Ветеринария" №12 2007