РазместитьА.В. Каньшина,
старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир, e-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.
А.В. Щербаков
ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук, ФБГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир
РЕЗЮМЕ
В статье описываются результаты нашего участия в международных сравнительных испытаниях по серодиагностике репродуктивно-респираторного синдрома свиней, организованных компанией GD Animal Health Service Deventer (Нидерланды). Результаты испытаний 2011 и 2012 годов свидетельствуют о том, что разработанная и используемая в нашей лаборатории тест-система для определения антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней обладает высокой чувствительностью и специфичностью и стабильно демонстрирует достоверные результаты.
ВВЕДЕНИЕ
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - инфекционное вирусное заболевание, характеризующееся репродуктивными проблемами у свиноматок и респираторными заболеваниями молодняка [12]. К настоящему времени РРСС широко распространен в большинстве стран с развитым свиноводством и характеризуется большими экономическими потерями [2,10]. По данным Kelley Т., 2004 [9] и Neumann E.J., et al. 2005 [б], потери США от РРСС составляют от 560 до 762 млн. долларов. Огромный ущерб свиноводству Китая нанесла эпизоотия высокопатогенного РРСС, начавшаяся в 2006 г. [8]. Ежегодно свиноводческая индустрия КНР теряет от этого заболевания до 20 млн. голов свиней [11].
В связи с экономической значимостью РРСС актуальной проблемой является диагностика этого заболевания. В серологической диагностике РРСС наиболее широко применяются различные варианты иммуноферментного анализа (ИФА) [4,5,7,13]. Несмотря на то, что среди серологических методов нет метода официально признанного как «золотой стандарт» [10], фактически таковым считают коммерческий набор, выпускаемый фирмой IDEXX [3].
В нашей лаборатории для выявления антител к вирусу РРСС был разработан непрямой вариант ИФА, основанный на использовании в качестве антигена рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса [1]. В 2011 г. и 2012 г. разработанный метод прошел проверку в международных сравнительных испытаниях по серодиагностике РРСС, организованных компанией GD Animal Health Service Deventer (Нидерланды). В данной статье описываются результаты сравнительных испытаний.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сыворотки крови: панели сывороток крови свиней для участия в международных сравнительных испытаниях были получены из GD Animal Health Service Deventer (Нидерланды) в 2011 и 2012 гг. (табл.1).
ИФА. Исследование сывороток проводили согласно «Методике выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней по одному разведению в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного протеина (rNC)». Методика утверждена 05.12.2001 г.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В 2011 г. в испытаниях принимали участие 71 лаборатория из 31 страны. Большинство (47) участников
Сравнение с другими участниками свидетельствует о том, что полученные нами результаты можно оценивать как очень хорошие. В пробе №3(РРСС-позитивная сыворотка, разведенная в 16 раз) из 47 участников, применявших набор IDEXX PRRSV ХЗ, только двум удалось обнаружить антитела к вирусу РРСС. Определить как серопозитивную пробу № 5 (РРСС-позитивная сыворотка, разведенная в 8 раз) удалось лишь 18 из этих 47 участников. Участники, использовавшие другие коммерческие наборы (версия 2XR IDEXX, Ingenaza, Hipra и др.), имели больше проблем с чувствительностью, а некоторые, даже со специфичностью.
В международных сравнительных испытаниях 2012 г. участвовали 56 лабораторий.48 участников применяли набор IDEXX PRRSV ХЗ, 5 - набор фирмы BioChek, 1 - набор фирмы Ingenasa, а два участника (в т.ч. ФГБУ «ВНИИЗЖ») использовали тест-системы собственного производства (в табл.3 показаны результаты лабораторий, применявших коммерческие тест-системы).
Как и в 2011 г., мы правильно определили негативную сыворотку и 15 из 17 серопозитивных образцов
использовали набор фирмы IDEXX PRRSVX3, который на сегодняшний день считается лучшим на мировом рынке. Мы применяли непрямой вариант ИФА (н-ИФА) собственной разработки. Результаты испытаний отражены в табл. 2 (в таблице приведены результаты лабораторий, применявших коммерческие тест-системы).
Панель образцов включала только одну сыворотку, не содержащую антител к вирусу РРСС, ее правильно определили как негативную. Из 17 положительных сывороток правильно определили 15. Как негативные нами были определены позитивные сыворотки №5 и №3, разведенные организаторами испытаний соответственно в 8 и 16 раз. Учитывая, что все сыворотки при постановке н-ИФА разводятся в 20 раз, фактическое разведение этих образцов при анализе составляло 1:160 и 1:320, соответственно. Необходимо отметить, что в сравнительных испытаниях разведения положительных образцов включаются для оценки аналитической чувствительности тест-систем и не учитываются при определении их диагностической чувствительности.
Табл. 2. Результаты участия в международных сравнительных испытаниях по серодиагностике РРСС в 2011 году
Табл. 3. Результаты участия в международных сравнительных испытаниях по серодиагностике РРСС в 2012 году
Примечание: * - несовпадающие результаты тестирования в 2-х повторностях. Пол - положительный результат, отр - отрицательный результат, сомн - сомнительный результат.
(табл. 3). Антитела к вирусу РРСС не удалось выявить только в сыворотках, разведенных в 8 и 16 раз. Интересно, что в 2012 г. из 48 участников, использовавших набор IDEXX PRRSV ХЗ, только один определил как серопозитивную пробу, разведенную в 16 раз, и 4 участника в двух повторностях выявили антитела к вирусу РРСС в пробе, разведенной в 8 раз. Почти половина (23 из 48) лабораторий, применявших набор IDEXX PRRSV ХЗ, имели проблемы с определением статуса сыворотки №8, которая была получена от свиньи, инфицированной вирусом РРСС американского генотипа, в острой фазе болезни. Мы правильно определили эту пробу как положительную.
Таким образом, используя собственную тест-систему, мы показали такие же высокие результаты, как и большинство участников испытаний, применявших «золотой стандарт» серодиагностики РРСС-набор IDEXX PRRSV ХЗ.
Результаты участия в международных сравнительных испытаниях в 2011 и 2012 гг. свидетельствуют о том, что разработанная и используемая в нашей лаборатории тест-система для определения антител к вирусу РРСС обладает высокой чувствительностью и специфичностью и стабильно демонстрирует достоверные результаты.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Каньшина А.В. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней: дисканд. вет. наук.-Владимир, 2004. - 123 с.
2. Agedependent resistance to porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication in swine /K.L. Klinge [et al.] //Virol. Journal. - 2009. -Vol. 6.- P. 177.
3. Comparison of two commercial ELISA systems for the detection of PRRSV-specific antibodies with a gold standard ELISA / W. Sipos [et al.] // Wien Tierartztl Monatsschr. - 2009. -Vol. 96, №1 -2. - P. 28-33.
4. An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus / E. Albina [et al.] // Ann Rech. Vet- 1992.-Vol. 23.-P. 167-176.
5. An indirect ELISA for the detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant nucleocapsid protein as antigen / H. Denac [et al.] // J. Virol. Methods. - 1997. - Vol. 65. - P. 169-181.
6. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States / E.J.Neumann [et al.] // J. Am. Vet. Med. Assoc. - 2005. - Vol. 227. - P. 385-392.
7. Cho H.J., Deregt D., Joo H.S. An ELISA for porcine reproductive and respiratory syndrome: production of antigen of high quality/Can.J.Vet. Res.- 1996.-Vol.60 - P. 89-93.
8. Emergence of fatal PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark/ K. Tian, X. Yu, T. Zhao [et al.] // PLoS ONE. -2007. -Vol. 2, № 6. - P. 526.
9. Kelley T. Paying the price of PRSS. The business magazine for professional pork producers. - 2004.
10. Nucleocapsid protein-based ensyme-linked immunosorbent assay for differentiation of antibodies against European and North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus / T. Seuberlich [et al.] // Clin. Vaccine Immunol. - 2002. - Vol. 9, №6.-P. 1183-1191.
11. Secondary infection with Streptococcus suis serotype 7 increases the virulence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs / M. Xu, S. Wang, L Li [et al.] // Virol. - 2010 Aug 9;7:184.
12. The probability of transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSv) to na'fve pigs via fresh meat/The EFSA Jornal. -2005. -Vol. 239.-P. 1-85.
13. Validation of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus / N. H. Ferrin [et al.] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2004. - Vol. 11.-P. 503-514.
журнал "Ветеринария сегодня" №2 2012
