Паршуков А. Н., Иешко Е. П., Ильмаст Н. В., Юхименко Л. Н., Дружинина А. А., Тархов С. В.
ФГБУН Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук
Введение
Применяющееся в литературе выражение «чума щук» выступает как обозначение болезни, которое не имеет ничего общего как с острым природно-очаговым инфекционным заболеванием - чумой, так и с видовой принадлежностью, поражая, кроме щук, и другие виды рыб. По данным авторов [8] в 1968 г. на озере Большой Берчикуль «чума щук» привела к массовой гибели окуня
Рис. 1. Озеро Каменное, район взятия проб.
и ерша, а в одном из учебных пособий [4] авторы выделяют, помимо чумы щук, еще чуму лососей и сигов.
Данные о заболевании регистрируются начиная с двадцатых годов XX столетия, однако до сих пор возбудитель окончательно не установлен. В литературе [9, 4] приводится подробное описание чумы щук с историческими сведениями, общей картиной заболевания, предполагаемыми возбудителями, опытами и специфичными признаками, но в последующих трудах [10] «чума щук» по-прежнему определяется как болезнь с недостаточно изученной этиологией. Дальнейшим этапом в развитии знаний об инфекции стали данные, которые позволили отнести ее к разделу «слабо изученные болезни предположительно бактериальной природы» [1]. Согласно современным представлениям Головина и др. (2007), считается, что в солоноватых водах чуме щук соответствует болезнь под названием вибриоз, тогда как в пресных водах встречается заболевание со схожими признаками, за которым сохранилось название «чума щук». В большинстве случаев эпизоотия приурочена к весеннему периоду, совпадающему с нерестом щуки, а само заболевание может стать причиной скоротечной высокой смертности рыб.
В июне 2012 г. в озере Каменное, расположенном практически полностью в границах заповедника «Костомукшский», зафиксирован случай массовой гибели щуки. В данной статье представлены результаты изучения качественного состава микрофлоры внутренних органов щуки и определения первичного возбудителя инфекции.
Материалы и методы
Озеро Каменное (рис. 1) (64° 3 Г 59.5" с. ш. 30° 15' 21.7" в. д.) принадлежит к бассейну Белого моря (водосбор реки Кемь) и является одним из верхних звеньев системы реки Чирка-Кемь.
Исследованный водоем входит практически целиком в границы ГЗ «Костомукшский», и в связи с этим рыбное сообщество не испытывает антропогенного влияния как со стороны промысла, так и загрязнения вод.
Материалом для исследования стали 23 экз. щуки (Esox lucius L.), отловленные в озере Каменное в июне 2013 и 2014 гг. В местах, где производился лов рыбы, отобрано 15 проб воды.
Для выделения бактерий и их дальнейшего изучения у живой рыбы стерильно получены образцы паренхиматозных органов (печени и почек). Посев патматериала производили растиранием (метод «штриха») по секторам в чашках Петри на плотные питательные и элективные среды: эритрит-агар, Эндо, Сабуро, энтерококкагар, висмутсульфит агар и кровяной агар (КА). Посевы инкубированы в термостатах при температуре 22 и 37 °С. Для описания морфологических свойств бактерий мазки окрашены по Граму, а затем исследованы при помощи светового микроскопа с иммерсией. Дополнительно проводился тест на определение цитохромоксидазы.
Для дальнейшего изучения отобранные колонии пересевали на первично-дифференцирующую среду Клиглера. Идентификацию аэромонад проводили по признаку утилизации салицина, L-арабинозы и эскулина [11].
Отбор проб воды проведен в 9 местах с глубины 10-15 см от поверхности с обязательным соблюдением условий асептики и взятием материала в стерильную посуду в количестве 1 500 мл. Бутыли с водой плотно закрывали пробками и доставляли в течение 30 минут в передвижную лабораторию.
При микробиологической оценке воды использованы количественные (уровень обсемененности) и качественные (таксономические) показатели. Санитарно-микробио-логический анализ включает определение основного показателя - индекса ЛКП - и до-полнительных: количества сапрофитных микроорганизмов, индексов Escherichia coli, энтерококков, присутствия сальмонелл и шигелл.
Для установления систематической принадлежности изучаемых микроорганизмов использованы определители [6].
Встречаемость (Р) высчитывали как про-цент особей, контаминированных конкретным видом бактерий:
P = (N.x 100%)/N,
где N. - число обсемененных рыб, N - число обследованных рыб.
Результаты исследований
Микрофлора рыб. На следующий год после массовой гибели рыб из 10 щук, пойманных в 2013 году, только у одной рыбы рост бактериальной флоры на питательных средах из печени и почек отсутствовал. Через год, в июне 2014 г., среди 13 изученных рыб у 11 посевы из внутренних органов оказались стерильными.
Максимальное разнообразие состава микрофлоры было обнаружено в 2013 г., когда на средах Эндо, эритрит-агар и Сабуро выделены Bacillus sp., Moraxella, Aeromonas, Acinetobacter, бактерии группы кишечной палочки (БГКП), миксобактерии и плесневые грибы (рис. 2). В июне 2014 г. на этих же средах наблюдался рост небольшого числа бактерий, среди которых идентифицированы Hafnia alvei, Plesiomonas spp. и Alcaligenes faecal is (рис. 3).
В июне 2014 года у щуки весом более 2 кг на теле были отмечены язвы, в то время как в 2013 г. внешние поражения кожи мог-ли встречаться как у крупных, так и у более мелких особей весом около 400 г (табл. 1).
Рис. 2. Микробиоценоз щук из озера Каменное (2013 г.).
Рис. З. Микробиоценоз щук из оз. Каменное (2014 г.).
Таблица 1.
Обнаружение внешних признаков заболевания и размерно-весовые показатели щук из озера Каменное в 2013-2014 гг.
Микрофлора воды. В 2013 г. число сапрофитных бактерий на МПА оказалось на уровне менее чем 101 КОЕ/мл, во всех посевах присутствовали плесневые грибы и бактерии группы кишечной палочки, а в одной из проб - анаэрогенные аэромонады и моракселлы. В состав микрофлоры также входили бактерии Bacillus sp. и флавобактерии.
Общее число сапрофитных микроорганизмов в 2014 г. не превышало значение 20 КОЕ/мл. Из исследованных проб общие колиформные бактерии (ОКБ), термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ), возбудители кишечных инфекций и плесневые грибы не выделены. Бактериоценоз воды представлен грамположительной кокковой микрофлорой и идентифицированным видом Bacillus cereus.
Обсуждение результатов
В начале июня 2012 г. отмечалась высокая смертность щуки на озере Каменное. Наблюдающиеся у погибших рыб поражения кожи соответствовали признакам, которые указаны в литературе для болезни «чума щук»: различного рода язвы, без нагноений [9, 4, 1]. В основном такое название можно встретить в работах отечественных авторов, тогда как в зарубежных источниках приняты сочетания pike disease, septicaemic or ulcerative infections или red sore disease. Еще Шеперклаус считал, что от названия «чума щук» следует отказаться, поскольку оно вводит исследователей в заблуждение [17].
Гибель рыб в 2012 г. происходила в весенний посленерестовый период. В 2012— 2013 гг. были отмечены только случаи встречаемости щук с язвами на теле (рис. 4), сведений о гибели рыб не было.
В ходе анализа бактериологических данных, полученных за 2013 и 2014 гг., установлено, что микробиоценоз паренхиматозных органов щуки представлен разнообразной микрофлорой, которую согласно определителю [6] можно разделить на 4 группы бактерий. Группа 4. Грамотрицательные, аэроб-ные/микроаэрофильные палочки и кокки.
Рис. 4. Внешний вид повреждений (язвы) на поверхности тела у щук, пойманных в июне 2013 г.
Группа 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки. Группа 15. Нефотосинтезирующие, не образующие плодовых тел скользящие бактерии. Группа 18. Грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры.
Из литературных описаний известно, что вопрос о составе кишечной микрофлоры у рыб достаточно хорошо изучен [14]. Относительно содержания микробного населения в паренхиматозных органах рыб нет единого мнения: одни авторы приводят аргументы в пользу встречаемости у здоровых рыб тех же микроорганизмов, что и у больных, но в меньшем объеме. Другие, наоборот, склоняются к полному отсутствию бактерий в печени, почках и селезенке [5]. Тем не менее полагаем, что выделение плесневых грибов и условно-патогенной микрофлоры (группа 4 и 5) из печени и по-чек у щук считается нетипичным и свидетельствует о снижении защитных сил организма.
В 2013 г. клинические признаки заболевания в виде характерных язв на теле обнаружены только у самцов, микробиоценоз которых представлен видами Moraxella sp., тогда как самки были внешне здоровы. Идентифицированные бактерии относятся к условно-патогенной микрофлоре и существенного вреда рыбе не приносят. Но заселение ими внутренних органов может ухудшать общее состояние организма и приводить к снижению темпов роста, стрессоустойчивое™ и иммунных реакций [12].
Помимо моракселл, наибольший интерес представляют ацинетобактеры и аэромонады (рис. 5), появление которых ассоциируется с развитием бактериальной геморрагической септицемии.
В сравнении с предыдущими годами данные 2014 г. по заболеванию рыб оказались более благоприятными, поскольку количество случаев поражения щук уменьшилось и среди пойманных нами 16 экземпляров повреждение отмечено только для 1 особи (рис. 6).
Рис. 5. Бактериальный рост на чашках Петри со средой Эндо (А) и Сабуро (Б). Посевы из паренхиматозных органов щуки (печень, почки).
Рис. 6. Внешний вид повреждений (язвы) на поверхности тела у щуки, пойманной в июне 2014 г.
У щуки с язвами выделить возбудителя инфекции также не удалось, но в посевах печени одной из особей из озера Каменное впервые за 2013-2014 гг. обнаружены представители рода Hafnia, вид Hafnia alvei.
Эти данные согласуются с тем, что известно в литературе. Энтеробактерии Hafnia alvei встречаются в кишечнике пресноводных рыб [13] и относятся к представителям нормальной микрофлоры щук [14]. Интересным остается то, что, по мнению зарубежных специалистов [16], бактерии Hafnia alvei способны поражать выращиваемую на фермах кумжу Salmo trutta L., вызывая у нее признаки геморрагической септицемии. Таким образом, Hafnia alvei можно рассматривать в роли возможного этиологического агента при болезни чумы щук.
Также в микрофлоре щук в июне 2014 г. встречались Plesiomonas spp., которые являются представителями нормальной микрофлоры рыб и широко распространены в пресных водоемах [15], и Alcaligenes faecalis - сапрофитные обитатели воды и кишечного тракта позвоночных [6].
Указанный в литературе возможный инфекционный возбудитель чумы щук Aeromonas punctata forma pelis не обнаружен, однако среди выделенных видов аэро-монады встречались: это Aeromonas sobria и Aeromonas sp. 5. Известно также, что в Финляндии у больных щук из язв были выделены нетипичные формы бактерий Aeromonas salmonicida, привычно ассоциирующихся с фурункулезом лососевых рыб [18]. Ранее об этом же сообщала Plehn (1911), тем не менее посчитавшая недостаточно убедительной свою находку A. salmonicida у щук [9].
Проведенные исследования показали, что после вспышки заболевания и массовой гибели щуки на озере Каменное в 2012 г. в последующие годы наблюдается постепенное улучшение эпизоотической ситуации. В 2013 г. у рыб обнаружен широкий набор патогенов - ацинетобактеры, моракселлы и аэромонады, способных привести к развитию бактериальной геморрагической септицемии. Однако клиническая картина и обсемененность внутренних органов летом 2014 г. характеризуются как более благо-приятные из-за единичных случаев обнаружения язв на коже у рыб и низкого микробного числа.
По данным 2009-2011 гг. щука в озе-ре Каменное встречалась повсеместно [2]. Предположительно, высокая численность щуки в водоеме могла стать причиной ее стрессированного состояния, что повлияло на интенсивное течение и распространение эпизоотии. Кроме того, в весенне-летний период после нереста особи сильно ослаблены, и способность противостоять развитию инфекции снижается. В подтверждение сказанному демонстрируется установленное разнообразие в 2013 году у щук условно-патогенной микрофлоры и плесневых грибов. Своего рода высокую смертность у щук можно рассматривать как природный механизм саморегуляции численности по разряжению переуплотненного рыбного населения.
Известно также, что качество водной среды оказывает влияние на развитие инфекционного процесса у рыб. При загрязнении водоема среда становится агрессивной за счет активизации роста численности и смены видового состава микрофлоры. В отношении проб воды из озера Каменное за период исследований наблюдается положительная динамика, где показатели 2014 г. соответствуют требованиям качества поверхностных водоемов. Общее число сапрофитных микроорганизмов не превышает 20 КОЕ/мл. В представленных пробах общие колиформные бактерии, термотолерантные колиформные бактерии, возбудители кишечных инфекций и плесневые грибы не выделены.
В 2013 году, несмотря на то что число сапрофитных бактерий на МПА было в пределах нормы (не более 101 КОЕ/мл), во всех посевах присутствовали плесневые грибы и бактерии группы кишечной палочки, а в одной из проб - анаэрогенные аэромонады и моракселлы, что характерно для органического загрязнения водоема.
Полученные результаты соотносятся с двухлетним периодом мониторинга акватории возле станции на озере Каменное при однократном взятии проб (один раз в год), что явно недостаточно и позволяет сделать лишь предварительные выводы о состоянии водоема и происходящих в нем процессах. При этом обязательно нужно учитывать все возможные условия отбора проб (климат, гидрология и т. д.), поскольку, как показали наблюдения, протоколы результатов исследований в один день могут указывать на загрязнение, а в другой - на полное соответствие выдвигаемым нормам и требованиям.
Заключение
Эпизоотическая ситуация на озере Ка-менное имеет общую положительную тен-денцию в снижении уровня напряженности по бактериальному заболеванию чумой щук. Описанный в литературе возбудитель инфекции Aeromonas punctata forma pelis не найден, но по нашим данным возможным этиологическим агентом могут выступать Aeromonas, Moraxella sp. и Hafnia alvei. Для определения более точной картины причин развивающегося эпизоотического процесса и окончательного возбудителя инфекции рекомендуется продолжать ежегодный мониторинг состояния микрофлоры рыб и воды на озере Каменное.
Общее количество бактерий в пробах воды с озера Каменное летом 2013-2014 гг. соответствует нормам и колеблется в преде-лах от 10М О3 КОЕ/мл.
Финансовое обеспечение исследований осущест-влялось из средств: федерального бюджета на вы-полнение государственного задания (Тема № 0221-2014-0004).
Исследования выполнены на научном оборудова-нии Центра коллективного пользования ИБ КарНЦ РАН «Комплексные фундаментальные и прикладные исследования особенностей функционирования жи-вых систем в условиях Севера».
Список литературы
1. Бауер, О. Н. Ихтиопатология / О. Н. Бауер, В. А. Мусселиус, В. М. Николаева, Ю. А. Стрелков. - М. : Пищевая промышленность, 1977. -431 с.
2. Биота северных озер в условиях антропогенного воздействия. - Петрозаводск : Карельский научный центр РАН, 2012. -230 с.
3. Головина, Н. А. Ихтиопатология / Н. А. Головина, Ю. А. Стрелков, В. Н. Воронин, П. П. Головин, Е. Б. Евдокимова, Л. Н. Юхименко ; под ред. Н. А. Головиной, О. Н. Бауера. - М. : Мир, 2003. - 448 с.
4. Догель, В. А. Бактериальные заболевания рыб / В. А. Догель, М. А. Пешков, Н. В. Гусева. - М. : Пищепромиздат, 1939. - ПО с.
5. Конев, Н. В. Нормальная микрофлора рыб и ее роль в возникновении бактериальных заболеваний, вызванных стрессом / Н. В. Конев // Научные тетради. - СПб. : ГосНИОРХ. - 1996. - Вып. № 4. - 46 с.
6. Определитель бактерий Берджи : в 2 т. / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. -М. : Мир, 1997. - 368 с.
7. Плотников, А. О. Морфофизиологическая характеристика бактерий, населяющих слизистую кишечника щуки (Esox lucius L.) / А. О. Плотников, Ж. В. Корнева, Г. И. Извекова // Биология внутренних вод. - 2010. - № 2. - С. 77-85.
8. Поляков, А. Д. Пути повышения продуктивности озера Большой Берчикуль / А. Д. Поляков, Г. Т. Бузмаков // Современные наукоемкие технологии: Материалы конференции. - 2005. - № 10. - С. 102-103.
9. Шерешевская, Н. В. Щучья чума / Н. В. Шерешевская // Известия Ленинградского научно-исследовательского ихтиологического института. - 1931. — Т. XII. - 135 с.
10. Щербина, А. К. Болезни рыб / А. К. Щербина. - Киев : Урожай, 1973. - 403 с.
11. Юхименко, Л. Н. Биологические свойства аэромонад и их роль в патологии рыб / Л. Н. Юхименко, Г. С. Койдан, Л. И. Бычкова, Л. П. Смирнов // Рыбное хозяйство. Серия: Болезни гидробионтов в аквакулыуре. Аналит. и реф. информ. - М. : ВНИЭРХ, 2001.-Вып. 1.-С. 1-10.
12. Addis, M. Influence of Moraxella sp. colonization on the kidney proteome of farmed gilthead sea breams (Spams aurata, L.) / M. Addis, R. Cappuccinelli, V. Tedde, D. Pagnozzi, I. Viale, M. Meloni, F. Salati, T. Roggio, S. Uzzau // Proteome Science. - 2010. - 8:50. - DOI 10.1186/1477-5956-8-50.
13. Austin, B. The bacterial microflora of fish / B. Austin // The Scientific World. - 2002. - 2. - P. 558- 572. -DOI 10.1100/tsw.2002.137.
14. Izvekova, G. I. Taxonomic characteristics and physiological properties of microorganisms from the gut of pike (Esox lucius) / G. I. Izvekova, N. V. Nemtseva, A. O. Plotnikov // Biology Bulletin. - 2008. - Vol. 35. - Issue6.-P. 592-598.-DOI 10.1134/S1062359008060058.
15. Jagger, T. D. Plesiomonas shigelloides - a veterinary perspective / T. D. lagger // Reviews of infectious diseases. - 2000. -Vol. 2. - № 4. - P. 199-210.
16. Orozova, P. Recovery of Hafnia alvei from diseased brown trout, Salmo tratta L., and healthy noble crayfish, Astacus astacus (L.), in Bulgaria / P. Orozova, I. Sirakov, V Chikova, R. Popova, A. H. Al-Harbi, M. Crumlish, B. Austin // Journal of Fish Diseases. - 2014. - Vol. 37. - Issue 10.-P. 891-898.-DOI 10.1111/jfd.l2212.
17. Schaperclaus, W. Fish Diseases / W. Schaperclaus. - 1992. -Vol. 2. - P. 487.
18. Wiklund, T. Atypical Aeromonas salmonicida isolated from ulcers of pike, Esox lucius L. / T. Wiklund // Journal of Fish Diseases. - Vol. 13. - Issue 6. - 1990. - R 541-544. -DOI 10.1111/j.1365-2761.199O.tbOO815.x.