Корочкина Е.А.
ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» г.Санкт-Петербург, Россия
Введение. Вступление России во Всемирную Торговую Организацию ставит перед агропромышленным комплексом задачу обеспечения продовольственной безопасности страны, важнейшим условием которой является развитие отечественного животноводства и повышение уровня его продуктивности за счет рационально организованного воспроизводства стада и снижения числа бесплодных самок и самцов. Вместе с тем в настоящее время наблюдается снижение воспроизводительной способности высокопродуктивных животных, одной из главных причин которого является воздействие таких стресс-факторов как нарушение условий кормления, содержания, эксплуатации и т.д. [3.4]. Несмотря на то, что многие аспекты влияния стресса на организм раскрыты, некоторые вопросы остаются до конца неизученными, в частности реакция организма на воздействие стресс-факторов различного генеза. Особенно это касается самцов, половая потенция и качество спермы которых отражаются на репродуктивной способности самок [1]. В связи с этим, целью настоящей работы явилось определение морфофункциональных основ и разработка практических методов коррекции длительного воздействия стресс-факторов на репродуктивную систему самцов.
Материалы и методика исследований. Эксперимент был выполнен на белых лабораторных крысах - самцах линии Вистар с исходной массой тела 150-175 г. в возрасте 6 месяцев и кобелях в возрасте двух-трех лет (породы бельгийские овчарки (малинуа), немецкие овчарки, восточно-европейские овчарки, Лабрадор, кокер-спаниель, бигли, беспородные) и состоял из четырех этапов. Предметом исследований явились кровь, семенники самцов крыс, сперма кобелей.
На первом этапе работы было проведено изучение влияния психоэмоциональных и физических стресс-факторов на структуру эритроцитов и морфофункциональное состояние надпочечников и семенников самцов крыс. Было сформировано три группы животных. У животных первой группы (п=20) было смоделировано состояние психоэмоционального стресса с помощью метода принудительного плавания по Sherwood A. [8]. У животных второй группы (п=40) - состояние физического стресса путем плавания с грузом массой 7,5 % от массы тела животного с фиксацией у основания хвоста (по методу Сорокина А.П. [2]). Животные третьей группы (п=20) не находились под воздействием стресса и являлись контролем. Крысы опытных групп плавали 7 раз в неделю в течение 8 недель. Первоначально время однократного плавания составило 5 минут, каждую неделю оно возрастало на 5 минут. Общий объем нагрузки составил 1260 минут. Спустя 8 недель после начала опыта животные выводились из эксперимента декапитацией с одновременным отбором проб крови для гематологического, гормонального и органов для гистологического исследований.
На втором этапе проведено изучение влияния стресса на качество спермы кобелей. С этой целью было сформировано две группы животных: первую группу (п=8) составили служебные розыскные собаки, находящиеся в состоянии стресса вследствие специальной интенсивной четырехмесячной тренировки: вторую группу (п=8) составили со-баки, не подвергавшиеся интенсивным тренировкам. От животных однократно получали эякулят путем мастурбации и проводили его визуальную и микроскопическую оценку.
На третьем этапе работы было изучено влияния препарата гемобаланс и метода абдоминальной декомпрессии на структуру эритроцитов и гормонопоэтическую функцию надпочечников и семенников крыс в условиях стресса. С этой целью было сформировано три группы животных. У всех крыс было смоделировано состояние физического стресса по методу Сорокина А.П. с соавт. [2], - принудительное плавание с грузом на протяжении 8 недель. При этом крысам первой группы (п=10) в течение последних двух недель применяли абдоминальную декомпрессию на аппарате АДТ-02 (модифицированный) в следующем режиме: 2 сеанса длительностью по 3 минуты каждый с интервалом 2 минуты, разряжение - 2кПа семикратно с интервалом 48 часов. Животным второй группы (п=10) в те же сроки вводили препарат гемобаланс в дозе 0,1 ми (per os) ежедневно. Крысы третьей группы (п=10) никаких дополнительных воздействий не получали и служили контролем. После завершения воздействия производили однократное взятие крови в объеме 5 мл для гематологических и гормональных исследований.
На четвертом этапе работы была дана оценка эффективности метода коллоидного центрифугирования для улучшения морфолопиеских показателей спермы, полученной от самцов, находящихся в условиях длительного воздействия стресс-факторов. С этой целью от восьми кобелей, находящихся в состоянии стресса вследствие интенсивной четырехмесячной тренировки, однократно методом мастурбации был получен эякулят. В дальнейшем каждый эякулят был разделен на две равные части, одна из которых подвергалась стандартному центрифугированию (700 оборотов в минуту на протяжении 6 минут), а вторая часть - одиночному коллоидному центрифугированию (300 оборотов в минуту на протяжении 20 минут) с использованием коллоидного раствора «Андроколл- С» объемом 15 мл.
В работе были использованы такие методики как морфологическое исследование эритроцитов (с помощью световой микроскопии по общепринятой методике [2]; определение концентрации гормонов кортизола и тестостерон в сыворотке крови (методом ИФА с использованием готовых наборов реагентов фирмы Алкор - Био): исследование гистологической структуры надпочечников и семенников (по общепринятой методике): визуальная оценка качества спермы однократно после получения, а также микроскопическая оценка - после получения, центрифугирования, охлаждения и оттаивания. Концентрация спермиев в эякуляте определена на аппарате Nucleocounter (Chemometic, Aller0d, Denmark), подвижность - с помощью компьютерного анализа спермы (Computer Assisted Sperm Analysis, Sperm Vision® 3.5. Minitub Abfull und Laborteclmik GmbH and CoKg, Germany), морфология по методу Williams WW., Cornell Vet [9], целостность плазматической мембраны с помощью флуоресцентного микроскопа (окраска материа-ла the fmorophores EthD-1 and SYBR-14 staining (Molecular probes Inc., OR, USA)), целостность акросом с помощью флуоресцентного микро-скопа (методика Ахпег [б]), нарушение организации хроматина с по-мощью метода проточной цитометрии (методика Evenson [7]).
Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью программных пакетов StatSoft Statistica 6.0. и Minitab® statistical software (Minitab Inc., State College, PA, USA).
Результаты исследований и их обсуждение. Нами установлено, что адаптация организма самцов к психоэмоциональному и физическому стрессу сопровождается значительными морфофункциональны-ми изменениями гонад. Согласно данным гистологического исследования семенников, у крыс, находящихся в условиях длительного воздействия психоэмоциональных и физических стресс-факторов, между базальными мембранами семенных канальцев и питающими их капил-лярами появляются оптические пустоты; отмечается небольшое оди-ночное количество клеток Лейдига преимущественно веретиновиднои формы, что указывает на их незрелость или слабую функциональную активность; при этом расстояние между базальными мембранами со-седн1гх канальцев увеличивается более чем в 20 раз по сравнению с животными, не подвергавшимися воздействию стресс-факторов. Изменения структурной организации семенников закономерно отражаются на их функциональной активности, что подтверждено эндокринными исследованиями крови самцов крыс (уровень тестостерон у животных, находящихся в условиях психоэмоционального стресса, снижается в 2.3 раза (р<0,05), а в условиях физического стресса - в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой), а также оценкой качества эякулята кобелей, находящихся в условиях стресса вследствие интенсивной четырехмесячной тренировки (снижается концентрация спермпев в 1,3 раза, подвижность спермиев - в 1.11 раза, скорость движения в 1,28 раза (р<0,05), число спермпев с целостной плазматической мембраной на 7,9 % и целостной акросомой на 13,5 %; возрастает число спермиев с нарушенной организацией хроматина в 1,7 раза, с патологическими формами хвостов - в 1,2 раза и головок - в 1,7 раза по сравнению с показателями качества спермы кобелей, не подвергав-шихся воздействию стресс-факторов).
Таким образом, в условиях хронического стресса происходят глубокие нарушения, как структурной организации, так и гормонопоэтической и генеративной функций семенников. Изучение стресскорректорных свойств метода абдоминальной декомпрессии и комплексного препарата гемобаланс показало, что локальное отрицательное давление (разряжение 2 кПА), применяемое крысам в области брюшной полости, семикратно с интервалом 48 часов способствует повышению количества нормальных эритроцитов на 2 - 4,5 %, снижению количества деформированных эритроцитов в 1,6 - 2,3 раза по сравнению с показателями животных, находящихся в условиях физического и психоэмоционального стресса.
Полученные данные гормонального исследования крови указывают на то, что применение метода абдоминальной декомпрессии и препарата гемобаланс оказывает положительное влияние на эндокринную функцию семенников и надпочечников крыс в условиях стресса. Уровень кортизона снижается в 2,8-3.1 раза: концентрация тестостерона увеличивается в 1,1 - 1,8 раза по сравнению с крысами, находящимися в условиях психоэмощшального и физического стресса.
В силу того, что длительное воздействие стресс-факторов на организм кобелей приводит к существенному снижению качества эякулята, актуальным является разработка физических способов улучшения качества спермы с последующей оценкой их эффективности. С этой целью было проведено сравнительное изучение метода коллоидного и стандартного центрифугирования спермы.
Установлено, что сперма, обработанная коллоидным центрифугированием, основанном на отделении популяции нормальных, функционально активных спермиев через коллоидный раствор Андрокол-С с плотностью 1,104 г/мл имеет высокие морфологические и функциональные параметры качества.
Так, после коллоидного центрифугирования наблюдалось значительное снижение процента патологических форм головок и хвостов спермиев в 1,1 - 1,8 раза, процента спермиев с поврежденной организацией хроматина в 1,3 раза; увеличение процента подвижности спермиев после оттаивания в 1,2 раза; увеличение процента спермиев с целостной плазматической мембраной в 1,3 раза, процента спермиев с неповрежденной акросомой в 1,5 раза (рис.5) по сравнению с данными показателями после стандартного центрифугирования.
Заключение. Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1.    Психоэмоциональный и физический стресс сопровождается
морфофункциональнымп изменениями семенников: появление оптических пустот между базальными мембранами семенных канальцев, уменьшение их внешнего диаметра в сочетании с уменьшением просвета канальцев; угнетение гормонопоэтической функции (снижение концентрации тестостерона в 1,5 - 2,3 раза (р<0,05); ухудшение качества спермы (снижение концентрации спермиев на 16 %; двигательной активности на 77 % (р<0,05); числа спермиев с неповрежденной плазматической мембраной на 7,9 %, с неповрежденной акросомой на 13,5 %, повышение числа спермиев с патологическими формами хвостов до 1,2 %, с патологическими формами головок на 4,4 % (р<0,05); с поврежденным хроматином на 3,7 %):
2.    Применение препарата гемобаланс и метода абдоминальной декомпрессии нормализует гормонопоэтическую функцию семенников крыс, находящихся в состоянии психоэмоционального и физического стресса: концентрация гормона тестостерон увеличивается с 1,1 до 1,8 раз;
3.    Метод коллоидного центрифугирования является новым эффективным способом улучшения качественных показателей спермы, полученной от кобелей, находящихся в условиях постоянного воздействия  стресс-факторов.   Его  применение  позволяет  снизить  число спермиев с патологическими формами хвостов в 1,8 раза, с патологи
ческими формами головок в 1,1 раза; с повреждением хроматина в 1,3 раза; увеличить подвижность спермнев в 1,2 раза: увеличить число спермиев с целостной плазматической мембраной в 1,3 раза, с неповрежденной акросомой в 1,5 раза.
ЛИТЕРАТУРЫ
1.    Дмитриев В.Б. Функциональные эндокринные резервы в селекции сельскохозяйственных животных. - Санкт-Петербург, 2009, с. 85 - 96.
2.    Кондрахин, И.П. Методы ветеринарной клинической диагностики / И.П. Кондрахин. -М.:КолосС. 2004. - 520с.
З.Нежданов А.Г. Успехи и перспективы развития идей А.П. Студенцова о бесплодии сельскохозяйственных животных / А.Г. Нежданов // Материалы междунар. науч.-практ. конф. посвящ. 100-летию А.П. Студенцова.-Казань, 2003.-С.29-35
4.    Никитин В.Я. Бесплодие и яловость сельскохозяйственных животных и меры борьбы с ними. Ставрополь, СХИ - 1982 - 23 с.
5.    Сорокин, А.П. Моделирование адаптации к физическим нагрузкам / А.П. Сорокин, Г.В. Стельников, А.П. Вазин. - Горький:  Горьковский мед. инст., 1972. - с. 70-
75.
6.    Axner. E. Capacitatiou time of feline epididymal spermatozoa / E.Axner, U. Herinansson, С Liude-Forsberg // Proceedings of the EVSSAR 3rd European Congress. - 2002. - 3. - p. 115-120.
7.    Evenson. D.P. Relarion of mammalian sperm chromatm heterogeneity to fertility / D.P. Evenson. Z. Darzynkiewicz. M.R. Melamed // Science. - 1980. - 210. - P. 1131-1133.
8.    Sherwood, A. Physiological determinants of hyperreactivity to stress in borderline hypertension/ A. Sherwood. A.L.Hinderliter,   K.C. Light // Hypertension. - 1995. - 25(3). - P. 384-390.
9.    Williams, WW. Technique of collecting semen for laboratory examination with a review of several diseased bulls / WW. Williams. - Cornell Vet. 1920. - P. 87-94.