Тулов Александр Валерьевич, ассистент каф. паразитологии
Tulov Alexander V, Assistant at the Parasitology Dept.
Звержановский Михаил Иванович, д. б. н., проф. каф. паразитологии1
Zverjanovskii Michael I, Doctor of Biology Science, Professor at the Parasitology Dept.
Янагида Тетсуя, Ph.D.2 / Yanagida Tetsuya, Ph.D.
Коняев Сергей Владимирович, к. б. н., научн. сотрудник, доцент каф. вет.-сан. экспертизы и паразитологии
Konyaev Sergey V, Ph.D., Research Worker*, Associate Prof, at the Dept. of Veterinary&Sanitatary Examination and Parasitology
Андреянов Олег Николаевич, к. в. н., ст. научн. сотрудник Andreyanov OlegN, Ph.D., Senior Research Worker
Малкина Анастасия Васильевна, преподаватель4 / Malkina Anastasija V, Lecturer4
Однокурцев Валерий Алексеевич, к. б. н., научн. сотрудник / Odnokurtsev Valery A., Ph.D., Research Worker
Бондарев Александр Яковлевич, к. б. н., директор / Bondarev Aleksander Ya., Ph.D., Director7
Середкин Иван Владимирович, к. б. н., доцент, зав. лабораторией
Seryodkin Ivan V, Ph.D., Associate Professor, Laboratory Chief
Есаулова Наталья Валерьевна, к. в. н., доцент каф. паразитологии и инвазионных болезней животных9 Esaulova Natalya V, Ph.D., Associate Professor at the Dept. of Parasitology and Invasive Diseases of Animals
Накао Минору, Ph.D.21 Nakao Minoru, Ph.D.
Сако Ясушито, Ph.D.2 / Sako Yasushito, Ph.D.
Ито Акира, Ph.D., проф.21 Ito Akira, Ph.D., Professor
Введение
На настоящий момент в мире описано 8 видов трихинелл, их принято разделять на две группы. В первой из них находятся виды, вокруг личинок которых в организме хозяина образуется капсула, - это Trichinella spiralis Owen, 1835; Т. nativa Britov et Boev, 1972; T. nelsoni Britov et Boev, 1972; T. britovi Pozio et al., 1992; T. murrelli Pozio et La Rosa, 2000; T. patagoniensis Krivokapich et al., 2012 [9]. Кроме того, к этой группе относят также три генотипа (Т6, Т8, Т9) трихинелл, т. е. внутривидовых вариаций, таксономический статус которых изучен еще не в полной мере, но каждый генотип включен в состав какого-либо вида. Во второй группе находятся виды, не образующие капсулу, -Т. pseudospiralis Garkavi, 1972; Т. рариае Pozio et al., 1999; Т. zimbabwenzis Pozio et al., 2002. Эти группы образуют две фило-генетические клады и имеют статус подродов: Trichinella (Bessonoviella) Garkavi, 1994 и Trichinella (Trichinella) Ralliet, 1895 [3].
Важной проблемой в изучении трихинеллеза является определение видовой принадлежности трихинелл. Несмотря на то, что в большинстве случаев виды Т. spiralis и Т. nativa хорошо различаются по форме образуемых ими капсул, также достоверно различие по форминдексу и длине капсулы между Т. spiralis и Т. britovi, точность определения составляет 98 % «на серии», что существенно осложняет работу исследователей. У Т. nativa ТА Т. britovi форминдексы очень близки 1,1-1,5 против 1,6-1,7 [1]. Вместе с тем Т. nativa, Т. spiralis и Т. britovi могут встречаться в природе на одной территории, а также неоднократно было показано заражение животных двумя видами трихинелл одновременно. Это диктует необходимость поиска более надежных методов определения видов трихинелл, чем морфологические. Изучение биологических свойств: устойчивость к замораживанию, приживаемость в организме разных хозяев, плодовитость самок, срок развития в средах, попарное скрещивание и др. [2,10] - требуют большого количества времени и трудоемки. Наиболее быстрыми и точными методами определения личинок трихинелл являются молекулярно-генетические. Метод секвенирования маркерных генов позволяет не только определить видовую принадлежность, но также в зависимости от выбора маркеров и их длины позволяет из-учить внутрипопуляционную изменчивость, выявить гибридные формы, исследовать филогенетические отношения. Несмотря на относительно высокую стоимость исследования, секвенирование является необходимым этапом исследования видового и генетического разнообразия трихинелл. Кроме того, на каждой вновь исследуемой территории могут быть обнаружены эндемичные виды трихинелл, а также ранее неизвестные геноварианты известных видов, существование которых не было учтено при разработке более доступных методов молекулярной диагностики.
В России отмечается 4 вида трихинелл: Т. spiralis, Т. pseudospiralis, T nativa и Т. britovi. При этом Т. nativa и Т. pseudospiralis были описаны впервые с территории При-морского края и Дагестана соответственно, и РФ является для них типовой территорией. Поэтому генетический анализ трихинелл с типовых территорий имеет ключевое значение для молекулярной систематики. Целью нашего исследования было изучить видовое и генетическое разнообразие трихинелл, паразитирующих у представителей семейства Canidae в России, а также определить основные показатели зараженности трихинеллезом этих животных.
Материалы и методы
Исследование представителей семейства Canidae производили на территории 8 субъектов Российской Федерации: в Алтайском, Приморском и Краснодарском краях, Рязанской, Нижегородской и Новосибирской области, Республиках Саха (Якутия) и Алтай. На трихинеллез исследовано 6 видов: енотовидная собака (Nyctereutes procyonoides), лисица обыкновенная (Vulpes vulpes), корсак (V. corsac), песец (Alopex lagopus), волк (Canis lupus), включая собаку (С. lupus familiaris), и шакал обыкновенный (С. aureus).
Для выявления личинок трихинелл при-меняли метод компрессорной трихинеллоскопии, а также метод переваривания в искусственном желудочном соке. Пробы для исследования отбирали из ножек диафрагмы и икроножных мышц. Поиск гельминтов осуществлялся при помощи стереоскопического микроскопа МБС-10 и Stemi. Изучение морфологии гельминтов проводилось с помощью фазово-контрастного микроскопа Axiolab с телесистемой. Измерения проводили с по-мощью программы «AxioVision Rel. 4.6». Сборы гельминтов хранятся в коллекции лаборатории паразитологии ИСиЭЖ СО РАН, паразитологическом музее кафедры эпизоотологии и паразитологии Института ветеринарной медицины Новосибирского государственного аграрного университета и Кубанского государственного аграрного университета. Для Алтайского края также были проанализированы данные отчетов управления ветеринарии края.
Для определения индекса формы (форминдекс) производили измерение диаметра (D) и длины (L) капсул. На основании этих данных вычислялся индекс формы (V) капсул трихинелл, который определялся как отношение длины к диаметру (V = L/D). Данный признак широко используется в зоологических исследованиях для оценки формы округлых объектов. Размеры приведены в миллиметрах.
Молекулярно-генетическое исследование проводилось в отдельных случаях. ДНК выделяли от одного экземпляра паразита, экстрагировали с использованием набора «DNeasy blood and tissue kit» (Qiagen) и использовали для ПЦР. Фрагменты мт-ДНК цитохром-С-оксидаза субъединица I (сох!) амплифицировали ПЦР с использованием пар праймеров, представленных ранее. Очистка ПЦР-продуктов проводилась с помощью ExoSAP-IT (GE Healthcare). Сиквенирование проводили с BigDyeTM Terminator v3.1 в 3500 DNA sequencer (Applied Biosystems). Обозначения изолятов указаны в таблице 1. В качестве контроль-ных были использованы как оригинальные последовательности, так и из GenBank. Анализ полученных данных проводили с помощью программы «MEGA5». В качестве контрольных последовательностей использовали: для Т. spiral is - «штамм ВИГИС» от лабораторной крысы (Rattus norvegicus) и DQ007890; Т. nativa - от бурого медведя (Ursus arctos) из Якутии, последовательность DQ007891; Т. britovi - DQ007892. Длина последовательностей приводится в парах оснований.
Анализируемые последовательности трихинелл
Таблица 1.
Таблица 2. Выровненные различия последовательностей фрагмента coxl трихинелл
Примечания: «.» - обозначены совпадающие нуклеотиды; «G», «Т», «А», «С» — обозначены замены в соответствующих позициях.
Результаты исследований
В результате анализа ДНК последовательности coxl были получены с длиной фрагментов 379 или 1545 пар оснований. Однако представленные в GenBank последовательности позволяют провести сравнение только по коротким фрагментам coxl. Данные о различающихся выравненных позициях представлены в таблице 2. При этом анализ различий проводился на участке гена с позиции с 726 по 1104 включительно, так как именно фрагменты coxl чаще всего были представлены в GenBank. В качестве референтной последовательности указана последовательность DQ007892 вида Т. britovi. Замены были выявлены в 85 позициях (табл. 2).
Последовательности мт-ДНК трихинеллы от лисиц, волков, енотовидных собак из Алтайского края и Республики Алтай, Якутии, Приморского края, Рязанской области наиболее сходны с последовательностями Т. nativa, депонированными в GenBank, от енотовидной собаки из Нижегородской области с последовательностями Т. spiralis, у этого же вида из Краснодарского края к Т. britovi.
Из 15 енотовидных собак, исследованных в Краснодарском крае, зараженных капсульными формами трихинелл было выявлено 5 животных (33,3 %). При этом форминдекс колебался от 1,2 до 2,1. Генетический анализ был проведен в одном случае -выявлена Т. britovi, подробнее эта находка обсуждена ниже. В Приморском крае было исследовано 8 экз., зараженных выявлено 3 (ЭИ = 37,5 %). Морфологические исследования капсул трихинелл от енотовидной собаки из Приморского края показали, что длина капсул 0,303-0,410, ширина-0,213-0,330, а средний индекс формы составил 1,3 (п = 9).
Генетический анализ показал 100 % сходство с последовательностью DQ007891 Т. nativa. В Рязанской области было исследовано 23 экз., из них зараженным оказалось одно животное (ЭИ = 4,3 %). В Нижегородской области было исследовано 3 животных, зараженным было одно. У обнаруженных трихинелл было выявлено 100 % сходство с после довательностями Т. spiralis штамма ВИГИС от лабораторных крыс.
Шакалы обыкновенные исследовались в Краснодарском крае, где из 150 исследован-ных животных зараженными Trichinella sp. оказались 83 (ЭИ = 55,3 %), Т. pseudospiralis - 4 экз. (ЭИ = 2,6 %). При этом в трех случаях установлена миксинвазия капсульным видом Т. (Trichinella) sp. и Т. (Bessoniviella) pseudospiralis. К сожалению, молекулярно-генетическое исследование в данном случае не проводилось, однако идентификация Т. pseudospiralis, сделанная по морфологическим признакам, не вызывает сомнений.
Волки в Алтайском крае и Республике Алтай были исследованы в количестве 70 экз. Зараженных животных было выявлено 13 (ЭИ = 18,5 %). Форминдекс составил 1,28 (п = 51). Во всех случаях по молекуляр-но-генетическим данным установлена инвазия Т. nativa. В Республике Саха (Якутия) исследовано 61 экз. волков, зараженных -6 (ЭИ = 9,8 %). У трихинелл от волков из Якутии длина капсулы составила 0,339-0,486, ширина - 0,260-0,408, индекс формы -в среднем 1,27 (п = 11). Последовательности мтДНК, проанализированные в двух случаях, позволяют отнести находки к виду Т. nativa, в остальных случаях генотипиро-вание не производилось. Собак в Алтайском крае было исследовано 18 экз., в Нижегородской - 3 экз.; зараженных не выявлено.
Лисиц обыкновенных в Алтайском крае зараженных трихинеллезом выявлено 4 экз. (ЭИ = 22,2 %) из 18 исследованных. Исследование морфологических особенностей капсул трихинелл у лисиц из Алтайского края показало, что форминдекс составляет 1,24 (п = 17). Молекулярно-генетическими методами была установлена принадлежность к виду Т. nativa. Анализ данных управления ветеринарии по Алтайскому краю за 2006-2010 гг. показал, что из 580 лисиц зараженных выявлено 41 (ЭИ = 7,01 %). В Якутии было обследовано 70 животных, из них зараженных - 3 (ЭИ = 4,2 %). Молекулярно-генетических исследований не производили. В Приморском крае было обследовано 4 животных, 3 из них заражено трихинеллезом (ЭИ = 75 %). В Рязанской области было обследовано 138 экз., зараженных выявлено -28 (ЭИ = 20,2 %). Во всех случаях анализ ДНК позволил определить их как Т. nativa. В Нижегородской области было исследовано 5 экз. животных, зараженных выявлено -2 (ЭИ = 40 %).
Среди корсаков из 27 исследованных в Алтайском крае было выявлено одно зараженное животное (ЭИ = 3,7 %). ДНК-анализ не производился.
У исследованных песцов клеточного со-держания (17 экз.) с территории Новосибирской области трихинеллез выявлен не был.
Обсуждение
В ходе анализа последовательностей гена мт-ДНК coxl были получены полные по-следовательности 1545 и фрагменты длиной 379 пар нуклеотидов. В базе GenBank депо-нированы фрагменты последовательности этого гена, как правило, не превышающие 379 нуклеотидов, что зачастую недостаточно для достоверного определения гено-типов, предложенных другими авторами, однако достаточно для видовых определений. Лишь для двух видов - Т. spiral is и Т. murelli - известен полный митохондри-альный геном. В связи с этим в дальнейшем необходимо проведение анализа полных последовательностей coxl для всех генотипов либо одновременное использование нескольких молекулярно-генетических маркеров. Предварительный анализ полных последовательностей гена coxl позволил выявить не только генотипическую принадлежность, но и некоторую корреляцию с географиче-ским распространением трихинелл. Однако для однозначных выводов требуется анализ значительно большего количества образцов из одного региона, а также от разных видов домашних и диких животных. Тем не менее, можно констатировать, что на территории России, по данным молекулярно-генетического анализа, у представителей семейства псовых отмечается три вида трихинелл, об-разующих капсулу и относящихся к подроду Trichinella (Trichinella): Т. nativa, Т. spiralis и Т. britovi. Экземпляры Т. (Bessonoviella) pseudospiralis были легко определимы по морфологическим признакам, а результаты молекулярно-генетических исследований будут представлены в отдельной работе.
Ранее было показано, что величина и форма капсул зависят главным образом от вида трихинелл и в гораздо меньшей степени от вида хозяина [2]. Форминдекс у капсул Т. spiralis, паразитирующих у собак, - 2,06. У всех видов животных капсулы вытянутые в длину вокруг личинок сохраняются у животных всю жизнь, что является характерным видовым морфологическим признаком для личинок Т. spiralis. Лисицы обыкновенные также восприимчивы к Т. spiralis, форминдекс капсул трихинелл в их мышцах равен 2,52. Такая форма капсул сохраняется в мышцах лисиц до конца жизни. У лисиц, заразившихся Т. spiralis в естественных условиях, капсулы были менее вытянуты в длину, форминдекс - 1,79. Капсулы Т. nelsoni у со-бак имеют форминдекс 2,24, через 3,5 года после заражения изменяясь незначительно до 2,23. Вокруг личинок Т. nativa формируются более округлые капсулы с наименьшим форминдексом. У собак форминдекс - 1,33, обыкновенных лисиц - 1,23 и сохраняется таким многие годы [2]. По данным других исследователей форминдексы Т. nativa и Т. britovi очень близки (1,1-1,5 против 1,6-1,7) [1]. Описания находок Т. britovi на территории современной России единичны. В публикациях до 1992 г. этот вид описывается как находки Т. nelsoni на территории Евразии [11].
На территории РФ наиболее распространенным видом трихинелл, паразитирующим у диких плотоядных семейства Canidae, является Т. nativa. Это утверждение подкрепляется морфологическими данными, исследованием устойчивости изолятов к замораживанию, в ряде случаев проверялся критерий скрещиваемости, а также проведены молекулярно-генетические исследования. Этот вид распространен по всей территории северной Евразии до изотермы января -6, что также подтверждается нашими данными [4-8]. Распространение Т. spiralis во многом зависит от деятельности человека, и определить границы его естественного ареала в настоящее время практически невозможно. Так, Т. spiralis образует синантропные и смежные очаги: в Нижегородской области этот вид отмечен у енотовидной собаки и барсуков в дикой природе [5]. Несмотря на многочисленные сообщения о находках Т. spiralis в Сибири, авторам не удалось получить ни одного образца данного вида от диких млекопитающих, обитающих в Сибири и на Дальнем Востоке.
Отдельного внимания заслуживает обнаружение Т. britovi у енотовидной собаки из Крымского района Краснодарского края. В мышцах животного обнаружили капсуль-ные трихинеллы двух форм: лимоновидной и эллипсовидной. Длина лимоновидных форм варьировала от 0,432 до 0,684, ширина составила 0,234-0,324, толщина стенки -0,027-0,045, форминдекс - от 1,5 до 2,1. Эллипсовидные формы имели длину
40
Агауальные вопросы ветеринарной биологии № 1 (17), 2013
ПАРАЗИТОЛОГИЯ
0,351-0,450, ширину - 0,234-0,324, толщину стенки - 0,027-0,054, форминдекс - от 1,2 до 1,6. Молекулярно-генетический анализ последовательности coxl, полученной от одной личинки, свидетельствует о при-надлежности ее к виду Т. britovi, сходство с последовательностью DQ007892 была равна 100 %, с последовательностью генотипа Т8 сходство - 93,8-94,5 %. Высокая вариабель-ность морфологических признаков могла быть связана с тем, что материал находился в морозильной камере при температуре -1О...-15°Св течение 3-4 месяцев. Поэтому личинки были деформированы, но целост-ность капсулы сохранена. Поскольку гене-тическому анализу был подвергнут только один экземпляр, также не исключено, что большой разброс показателей индекса фор-мы может быть связан с миксинвазией дву-мя-тремя видами трихинелл. Вопрос распространения других видов капсулообразующих трихинелл в Краснодарском крае требует дальнейшего изучения.
Выводы и заключение
В России отмечается 4 вида трихинелл. При этом Т. nativa и Т. pseudospiralis были описаны впервые с территории Приморского края и Дагестана соответственно, и РФ является для них типовой территорией. Поэтому генетический анализ изолятов с этих терри-торий имеет большое значение для молеку-лярной систематики. Необходим тщатель-ный анализ образцов из различных регионов от разных хозяев для выявления паразито-хозяинной специфичности различных гапло-типов либо, что более вероятно, выявления корреляций между гаплотипами мт-ДНК и географическим распространением трихинелл.
Работа выполнена при поддержке Рос-сийского фонда фундаментальных исследо-ваний (проекты: 12-04-31203, 13-04-10140).
Список литературы
1. Акимов, И. А. Использование морфологических показателей капсул личинок трихинелл (Nematoda: Trichinellidae) для их видовой идентификации / И. А. Акимов, Ю. М. Дидык // Вестник зоологии. — 2009.-№23.-С. 12-16.
2. Бритов, В. А. Трихинеллы и их использование в медицине / В. А. Бритов. - Владивосток : Изд-во Дальневосточного ун-та, 2006. - 464 с.
3. Гаркави, Б. Л. Трихинеллез, вызываемый Trichinella pseudospiralis (морфология и биология возбудителя, эпизоотология и эпидемиология, диагностика, меры борьбы и профилактика) / Б. Л. Гаркави // Российский ветеринарный журнал. — 2007. — № 2. — С. 35-116.
4. Есаулова, Н. В. Фауна гельминтов медведей острова Сахалин и юга Дальнего Востока России / Н. В. Есаулова, И. В. Середкин, С. В. Коняев,
A. В. Малкина, М. Ю. Борисов // Российский ветеринарный журнал. - 2012. - № 4 - С. 16-19.
5. Коняев, С. В. Молекулярно-генетические исследования Trichinella spp. в России: первые результаты / С. В. Коняев, А. В. Кривопалов, Т. Янагида, М. Накао, Я. Сако, А. Ито, А. В. Малкина, О. Н. Андреянов, B. А. Однокурцев, Н. В. Есаулова, И. В. Середкин, А. Я. Бондарев, Л. В. Ткаченко // Материалы Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии», 30 октября - 1 ноября 2012 г. в г. Москва. -М., 2012. - С. 171-174.
6. Малкина, А. В. Мониторинговое исследование зараженности представителей семейства куньих (Mustelidae) трихинеллами в Западной Сибири / А. В. Малкина, С. В. Коняев // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2012. — №4/1.-С. 33-34.
7. Малкина, А. В. Трихинеллез волков Евразии / А. В. Малкина, С. В. Коняев, А. Я. Бондарев, Л. В. Ткаченко, Г. М. Инговатова // Вестник НГАУ — 2010.-№4.-С. 10-14.
8. Малкина, А. В. Морфология капсул Trichinella sp. от плотоядных животных Западной Сибири / А. В. Малкина, В. П. Юшкевич, А. Я. Бондарев, C. В. Коняев, Л. В. Ткаченко, Г. М. Инговатова, А. В. Кривопалов, Л. А. Ишигенова, В. А. Охрименко // Материалы Международной научно-практической конференции «Проблемы изучения и сохранения культурного и природного наследия Евразии». - Павлодар, 2010. -Т. 2. -С. 109-112.
9. FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis: J. Dupouy-Camet and K. D. Murrell (eds.). - 2007. - 119 p.
10. Murrell, K. D. The systematics of the genus Trichinella with a key to species / K. D. Murrell, R. J. Lichtenfels, D. S. Zarlenga, E. Pozio // Veterinary Parasitology. - 2000. - 93. - P. 293-307.
11. Pozio, E. Taxonomic revision of the genus Trichinella / E. Pozio, G. La Rosa, K. D. Murrell, J. R. Lichtenfelst // The Journal of Parasitology. - 1992.