Печать
Категория: Ветеринария птиц

Г.К. Юров, СВ. Алексеенкова, К.П. Юров
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)» РАСХН.

ММ. Сайдарова,
НП «Биологические препараты» ТАСХН (Республика Таджикистан).

М. Амирбеков,
Служба государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан.

Ключевые слова: 

Сокращения: ДСН— додецилсулъфат натрия, ДТТ— дитиотрейтол, ИФА — иммуноферментный анализ, ОП— оптическая плотность, ПААГ— полиакриламидный гель, РТА —реакция гемагглютинации, SPF— specific pathogen free (свободные от специфических патогенов)

Введение

Вирусы гриппа имеют постоянного природного хозяина — птиц, у которых данная инфекция характеризуется разнообразным течением — от массового острого заболевания с летальностью, приближающейся к 100 %, до бессимптомной атипичной формы [7]. Локализация природных очагов и пути распространения вирусов гриппа связаны с местами гнездования и маршрутами перелета многих видов диких птиц. Через Республику Таджикистан пролегают основные пути миграции перелетных птиц из Индокитая и Китая. Вследствие этого на данной территории можно ожидать частые вспышки гриппа птиц. Действительно, ранее были обнаружены штаммы нескольких подтипов вируса гриппа птиц — Н6 (1972 г.), Н7 (1976—1978 гг.) и Н4 (1978— 1979, 1983—1984 гг.) [3].

Однако, несмотря на то, что в сопредельных странах периодически возникают эпизоотии высокопатогенного вируса гриппа птиц (H5N1), до настоящего времени вспышки этой инфекции в Республике Таджикистан не регистрировали [1], а результаты лабораторных исследований на грипп, проводившиеся в 2006—2010 гг. оставались отрицательными [2].

Цель исследования

Объективно оценить эпизоотическую обстановку по гриппу птиц в указанном регионе посредством ретроспективных иммунологических исследований с тем, чтобы выявить возможную циркуляцию вируса H5N1 в популяции домашней птицы.

Материалы и методы

Вирусы. В работе использовали штамм «A/ck/Skot/59» (H5N1) вируса гриппа птиц, предоставленный Центром ВОЗ в порядке научно-технической помощи Республике Таджикистан по программе «Проект по контролю за птичьим гриппом». Для размножения вируса использовали 9... 10-суточные куриные эмбрионы SPF (фирмы «VALO-SPF», Германия). Накопление вируса контролировали в РГА с 1 % взвеси куриных эритроцитов.

ИФА для обнаружения антител к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц. Для постановки реакции использовали коммерческий диагностический набор «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)» (фирмы «x-OvO», Великобритания) по инструкции разработчика.

ИФА для обнаружения антител к субтипоспецифическому антигену вируса гриппа H5N1 птиц. 96-луночные иммунологические планшеты (фирмы «Greinerbio», Германия) сенсибилизировали антигеном вируса гриппа птиц H5N1 в фосфатном буфере (рН 7,4). В качестве тестконтролей использовали отрицательную и положительную контрольные сыворотки из коммерческого диагностического набора «AniGen H5 AFV Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея). Сыворотки крови кур в двукратных разведениях инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После инкубации с сыворотками добавляли иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов класса G кур. В качестве хромогена использовали 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (фирмы «Медико — диагностическая лаборатория», Россия).

Электрофорез в буферной системе Лемли. ДСН-ПААГ электрофорез полипептидов вируса гриппа кур H5N1 проводили в буферной системе Лемли [6] в 12%-м ПААГ в пластинах толщиной 0,75 мм на аппарате для вертикального электрофореза (фирмы «Хеликон», Россия). Полипептиды разделяли в денатурирующих условиях с прогреванием в присутствии ДТТ, как было описано ранее [4].

Иммуноблотинг. После ДСН-ПААГ электрофореза проводили электроперенос на нитроцеллюлозную мембрану в полусухой буферной системе по методу Бюрнет [5]. Трек, содержащий маркер молекулярной массы белков (фирмы «Хеликон», Россия), окрашивали раствором Кумаси. Треки, содержащие антиген вируса гриппа птиц H5N1, использовали для постановки иммуноблотинга. Реакцию проводили с моноклональными антителами к гемагглютинину Н5 вируса гриппа птиц, отрицательными и положительными контрольными сыворотками из коммерческого диагностического набора «AniGen H5 АТУ Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея) и сыворотками серопозитивных кур из различных областей Республики Таджикистан. После инкубации с сыворотками полоски мембраны инкубировали с иммуно-пероксидазным коньюгатом против иммуноглобулинов класса G кур (для моноклональных антител — с иммунопероксидазным коньюгатом против иммуноглобулинов класса G мышей). В качестве блокирующего раствора использовали овальбумин в концентрации 0,2 %. Для проявления реакции использовали субстратную смесь на основе хромогена — ортодианизидина.

 

11

Результаты и обсуждение

Чтобы выявить антитела к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц, мы исследовали в ИФА пробы сывороток, полученных от кур из районов: Вахдат, Шахринав, Файзабад, Рашт Республики Таджикистан — с помощью диагностического коммерческого набора «FLOCKSREEN Avian Influenza vims ELISA KIT (AI)» (фирмы «x-OvO», Великобритания). Результаты приведены на рисунке 1. Антитела к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц в достоверно диагностических титрах были выявлены в пробах, полученных из 4-х административных районов. Наиболее высокие титры антител обнаруживали в сыворотках, полученных из района Шахринав и в более низких титрах — в пробах из других 3-х районов. Наличие иммунного ответа у кур на типо-специфический белок вируса гриппа А свидетельствует о циркуляции возбудителя гриппа в популяции птиц на территории Республики Таджикистан. Полученные результаты послужили основанием для продолжения исследований с целью выяснения подтиповой принадлежности вирусов.

Первостепенное значение мы придавали изучению возможной циркуляции штаммов высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1. Принимая во внимание отсутствие острых вспышек гриппа птиц в популяции кур Таджикистана, особый интерес представляло обнаружение с помощью методов ретроспективной иммуно-ферментной диагностики факта циркуляции гриппа птиц. С этой целью мы разработали тест-систему на основе непрямого варианта твердофазного ИФА для выявления антител у кур к субтипоспецифичекому антигену вируса гриппа птиц H5N1. Компоненты тест-системы использовали для исследования сывороток крови кур, полученных из районов: ГБАО (Горно-Бадахшанская автономная область), Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб, Вахдат, Рашт и Шахринав Республики Таджикистан. Результаты приведены на рисунке 2. Наиболее высокие титры антител в ИФА были выявлены в пробах из района Шахринав, и они превышают уровень антител положительного тест-контроля, что коррелирует с результатами по выявлению антител к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц. Данные, полученные по районам: ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб, по-видимому, объясняются проведенной вакцинацией кур против гриппа и не отражают картину распространения эпизоотического вируса.

Чтобы подтвердить специфичность результатов, полученных в ИФА, использовали иммуноблотинг. Предварительно был проведен вертикальный электрофорез в ДСН-ПААГ с целью аналитического разделения полипептидов вируса гриппа птиц H5N1. ДСН — один из наиболее эффективных детергентов, растворяющих не связанные ковалентно белковые агрегаты. Под действием ДСН в сочетании с восстанавливающим дисульфидные связи реагентом ДТТ и нагреванием при температуре 96° С все белки денатурируются и расщепляются на отдельные полипептидные цепи. Известно, что молекулы гемагглютинина вируса гриппа имеют молекулярную массу 70...80 кДа и состоят из двух субъединиц, соединенных дисульфидными связями. Таким образом, метод вертикального электрофореза в выбранной модификации приводит к разделению молекул гемагглютинина на субъединицы. Указанное обстоятельство подтверждают результаты наших исследований. Для иммуноблоттинга мы использовали положительный и отрицательный тест-контроли из коммерческого диагностического набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея), а также испытуемые пробы от серопозитивных кур. Сыворотки крови кур были получены из районов Шахринав и Рашт Республики Таджикистан, где домашнюю птицу не вакцинировали против гриппа. В качестве дополнительного контроля применили моноклональные антитела против гемагглютинина Н5 вируса гриппа птиц из коммерческого набора «AniGen H5 ATV Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, bic», Южная Корея). Результаты показали, что исследуемые сыворотки, положительная контрольная сыворотка и специфические моноклональные антитела взаимодействуют с вирусным гликопротеином с молекулярной массой примерно 35 кДа, что соответствует молекулярной массе субъединицы гемагглютинина вируса гриппа (рис. 3).

Библиография

1.  МахмадшоевМ.М., Тошматов Н. СайдароваМ.М. Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом. — Душанбе.: Служба государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства и охраны природы Республики Таджикистан при поддержке представительства ЮНИСЕФ, 2007.

2.  Сайдарова М.М., Амирбеков М., Юров Г.К., Алексеенкова СВ., Аноятбеков М., Юров К.П. Иммунологический мониторинг гриппа птиц на территории Республики Таджикистан // Иммунология, 2009;5:309—312.

3.  Салимов Т.М., Фатхудинова М.Ф., Тиллоев Т. Обзор: грипп птиц в Таджикистане. В кн. «Грипп человека, животных и птиц в Таджикистане». — Душанбе.: Душанбе, 2008.

4.  Юров Г.К., Народицкий Б.С, Ганиев А. Межмолекулярные дисульфидные связи поверхностных полипептидов вируса инфекционного ларинготрахеита кур. // Вопросы вирусологии, 1993; 4: 174—176.

5.  Burnette W.N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A // Anal Biochem, 1981; 112 (2): 195— 203.

6.  Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970; 227 (5259): 680—685.

7.  Lipatov A.S., Krauss S., Guan Y., Peiris M., Rehg J.E., Perez D.R., Webster R.G. Neurovirulence in Mice of H5N1 Influenza Virus Genotypes Isolated from Hong Kong Poultry in 2001 // Journal of Virology, 2003; 77 (6): 3816—3823.

Выводы

Обнаружение антител к типоспецифическому антигену нуклеопротеина вируса гриппа А птиц посредством ИФА и к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа птиц H5N1 посредством ИФА и иммуноблоттинга указывает, что домашняя птица (куры) на территории Республики Таджикистан (район Шахринав) имела контакт с вирусом гриппа птиц H5N1. Наличие у домашней птицы специфических иммуноглобулинов к высокопатогенному вирусу HP5N1 при отсутствии манифестной формы инфекции, очевидно, объясняется циркуляцией авирулентных штаммов возбудителя. Совпадающие результаты исследования при использовании трех отдельных методов регистрации иммунного ответа у птиц на типо- и субтипоспепифические антигены вируса гриппа птиц H5N1 свидетельствуют о достоверности полученных данных.

Российский ветеринарный журнал №1 2011